Транскриптомика одиночных клеток: различия между версиями

Развитие технологий секвенирования РНК отдельных клеток
2009	Впервые проведено секвенирование РНК отдельных клеток
2011	Технология STRT-Seq: улучшенное покрытие 5' конца
	Технология SMART-Seq: амплификация с полным покрытием
2012	Избавление от систематических ошибок при ПЦР с помощью in vitro транскрипции
2013	Технологии Quartz-Seq, DP-Seq, SMART-Seq2: удешевление процесса, улучшенная чувствительность
2014	Появление технологий с использованием уникальных молекулярных идентификаторов («штрихкодов»): STRT-Seq UMI, MARS-Seq, CEL-Seq UMI
2015	Технологии CytoSeq, SC3-seq: увеличение производительности

Интерактивная навигация по истории

[непроверенная версия]

← Предыдущая правка Следующая правка →

Содержимое удалено Содержимое добавлено

ВизуальныйВики-текст

Линейный

Версия от 04:53, 7 июня 2019

Транскриптомика отдельных клеток (англ. single-cell transcriptomics) — область биологических исследований, в которой основным инструментом служат методы количественного анализа экспрессии генов в индивидуальных клетках. Эти методы сочетают в себе современные технологии секвенирования РНК отдельных клеток (scRNA-Seq от англ. single-cell RNA sequencing) и последние достижения микрогидродинамики. Они позволяют решить проблему «усреднённых» данных, получаемых при традиционном секвенировании массовых популяций клеток.

Одноклеточное секвенирование РНК сделало возможными анализ клеточного многообразия в популяциях клеток, считавшихся ранее однородными; анализ траекторий развития клеток и моделирование динамики транскрипционных процессов — и всё это в очень высоком биологическом «разрешении», недостижимом при секвенировании ансамблей клеток. Из-за этого сильно возрастает размерность данных и, как следствие, вычислительная сложность анализа. Кроме того, несмотря на стремительное развитие, методы одноклеточного секвенирования всё ещё имеют определённые технические недостатки. В последние годы продолжают разрабатываться всё новые и новые биоинформатические методы для преодоления указанных проблем и получения более точных результатов экспериментов с отдельными клетками.

С помощью технологий одноклеточное секвенирования РНК и методов транскриптомики уже получены важные результаты в иммунологических, эмбриологических и онкологических исследованиях^[1]^[2]^[3].

Технология секвенирования РНК отдельных клеток

Несмотря на существенный прогресс в технологиях секвенирования, происходящий в последнее время, всё ещё достаточно трудоёмко секвенировать РНК отдельной клетки напрямую: сначала необходимо получить из неё комплементарную ДНК (кДНК). Кроме того, при одноклеточном секвенировании РНК исследователь должен решить две задачи, не возникающие при секвенировании ансамблей клеток: выделение отдельной клетки и амплификация очень небольшого количества РНК, содержащегося в ней. Вследствие этого, все технологии одноклеточного секвенирования имеют схожие этапы:

Отдельную клетку выделяют и лизируют.
Из клетки выделяют РНК и с помощью обратной транскрипции получают кДНК с баркодами, соответствующими индивидуальным.
Полученное малое количество кДНК амплифицируют путём полимеразной цепной реакции (ПЦР) или in vitro транскрипции.
Амплифицированную кДНК используют для подготовки библиотек и секвенирования.

Выделение отдельных клеток

Сортировка флуоресцентно активированных клеток

Этот метод комбинирует многопараметрическую проточную цитометрию и сортировку при помощи заранее заданной стратегии флуоресцентного стробирования. Флуоресцентно меченные антитела используются для отделения интересующих нас клеток в соответствии с целевыми поверхностными маркерами. На данный момент одновременно можно использовать до 17 антител^[5]^[6], что даёт возможность проводить продвинутое иммунофенотипирование, позволяющее определить интересные подмножества клеток даже в ранее изученных популяциях.

Другой вариант проточной цитометрии использует антитела к различным внутриклеточным белкам и отбирает клетки в зависимости от сигнала^[7]^[8]. Этот метод требует фиксации и пермеабилизации клеток^[7]^[8], что может усложнить последующий транскриптомный анализ.

Ограничения метода:

Необходимы антитела к интересующим белкам.
Не может обрабатывать образцы крайне малых объёмов (несколько микролитров).
Не подходит для анализа крайне редких клеток (одна интересующая нас клетка на миллион).
Не подходит для анализа клеток значительно отличающихся размеров.
Существующие на данный момент реализации не способны совмещать фотографирование и сортировку, препятствуя морфологическому анализу, но это может измениться в будущем^[9]^[10].

Микроманипуляция

Стеклянная микропипетка используется для отделения одной клетки из популяции под микроскопом. Микроманипуляция была успешно применена для выборки отдельных нейронов из первичной культуры^[11], отдельных клеток из эмбрионов различных стадий развития^[12] и бактерий^[13].

Ограничения метода:

Клетки отбираются вручную, это трудоёмкая процедура.
Небольшая скорость обработки клеток (несколько клеток в час).
Не может обрабатывать образцы крайне малых объёмов.

Оптический пинцет

Оптический пинцет использует сильно сфокусированный лазер для удержания и перемещения микроскопических диэлектрических объектов. В сочетании с отбором, основанным на фотографии, оптический пинцет может захватывать и манипулировать отдельными клетками в суспензии^[11] или в массиве внутри микрожидкостного устройства^[14]^[15]^[16].

Ограничения метода:

Требует продвинутого оптического оборудования.

Лизис клеток

Эукариотические клетки обычно лизируют в гипотоническом растворе. Осмотический дисбаланс приводит к избыточному поступлению воды в клетку, разрыву ее мембраны и выходу наружу клеточного содержимого. В зависимости от выделяемой субстанции (РНК, ДНК, белок) лизирующие буферы содержат дополнительные компоненты: так, в РНК-лизирующий буфер обычно добавляют белок-денатурирующие агенты (например, шаблон не поддерживает такой синтаксис), что помогает защитить РНК от деградации РНКазами^[17].

Получение и амплификация кДНК

После выделения РНК необходимо получить из нее комплементарную ДНК (кДНК) с помощью обратной транскрипции. Первая цепь кДНК синтезируется при помощи специально спроектированной версии обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей шаблон не поддерживает такой синтаксис. При синтезе первой цепи важно избавиться от мало интересующих нас рРНК и тРНК, которые составляют до 95% выделенной тотальной РНК клетки^[18]. Поэтому в большинстве методов выборочно обратно транскрибируют только полиаденилированные молекулы РНК , используя поли(dT)-праймер, что позволяет работать с наиболее интересными транскриптами, такими как мРНК и большинством длинных некодирующих РНК (длнкРНК).

Обратная транскрипция с олиго(dT)-праймеров

В простейшем случае cначала проводится отбор полиаденилированных РНК и синтез первой цепи кДНК с помощью поли(dT)-праймера (часто с адаптерной последовательностью). Непрореагировавшие праймеры и dNTP удаляют с помощью смеси экзонуклеазы и щелочной фосфатазы. Затем с помощью концевой дезоксинуклеотидил-трансферазы в среде, содержащей только один тип dNTP (dA), на 3'-конец синтезированной первой цепи кДНК навешивается дополнительный поли(А)-хвост примерно в 30 нуклеотидов. С помощью поли(dT) с другой заякоривающей последовательностью синтезируется вторая цепь и полученная двуцепочечная кДНК амплифицируется путем ПЦР^[19].

У этого подхода есть два основных недостатка. Из-за склонности ревертазы к раннему прерыванию 5’-конец имеет значительно меньшее покрытие. Кроме того, после добавления поли(А)-хвоста к 3’-концу кДНК вдобавок к обычному поли(А)-хвосту на 3’ конце РНК (то есть на 5' конце соответствующей кДНК) становится невозможно понять, с какой цепи ДНК эта РНК была изначально транскрибирована^[20].

Механизм смены матрицы SMART-seq^[21]

Чтобы получить однородное покрытие транскриптов был придуман механизм смены матрицы SMART-seq. Этот метод использует свойство ревертазы M-MuLV добавлять 3-4 цитозина на 3’-конце кДНК.

После синтеза первой цепи кДНК на матрице РНК добавляют универсальный ПЦР-праймер для смены матрицы с поли(G) и заякоривающей последовательностью. Он отжигается только на полноразмерные кДНК с цитозинами на конце, на 3’-конце которых благодаря этому достраивается заякоривающая последовательность. Затем проводят деградацию РНК, синтез второй цепи кДНК с праймером к заякоривающей последовательности и ПЦР-амплификацию. В результате амплифицируются только целые транскрипты, и информация об исходной цепи не теряется за счёт добавленных цитозинов. Однако этот метод обладает меньшей чувствительностью, чем добавление гомополимерного хвоста.

SUPeR-seq^[22]

Перечисленные выше подходы с использованием поли(dТ), однако, не позволяют секвенировать неполиаденилированные длнкРНК и кольцевые РНК, а также ограничены эукариотическими клетками. Разработаны альтернативные методы, позволяющие обратно транскрибировать как полиаденилированную, так и неполиаденилированную РНК, например SUPeR-seq.

В SUPeR-seq получение первой комплементарной цепи проводят с помощью праймера, 3'-конец которого представляет собой случайную последовательность, а 5'-конец — поли(dT) с заякоривающей последовательностью. Синтез второй цепи проводят по методу гомополимерного хвоста. Несмотря на отсутствие каких-либо специфических этапов очистки от рибосомальной РНК, SUPeR-seq дает достаточно качественный итоговый продукт амплификации, в котором только 1.5% прочтений картируются на последовательности рРНК. Предполагается, что ограниченное количество материала, полученное только из одной клетки, а также некоторые особенности лизиса и обратной транскрипции, используемые в этом методе, не позволяют раскрываться сложной вторичной структуре рРНК, что не дает ей транскрибироваться.

Транскрипция in vitro (CEL-seq)^[23]

В CEL-seq применяется поли(dТ)-праймер со специальным адаптером, баркодом и встроенным промотором Т7. Синтезириованные первые цепи кДНК отбирают на колонке при помощи первого адаптера, а затем амплифицируют путем in vitro транскрипции. Амплифицированная РНК фрагментируется на куски подходящего для секвенирования размера, к 3’-концам лигируется второй адаптер, а затем РНК конвертируется в кДНК путем обратной транскрипции. кДНК, содержащие оба адаптора, отбираются и амплифицируются с помощью ПЦР.

Этот метод позволяет амплифицировать РНК линейно, а также избежать необходимости смены матрицы, однако он лучше работает с 3’-концом исходного транскрипта, и каждый раунд амплификации приводит к укорачиванию транскрипта во время синтеза второй цепи.

Существует вариация метода — CEL-seq2^[24] — в которой после in vitro транскрипции проводят дополнительный этап обратной транскрипции амплифицированных РНК, что позволяет улучшить чувствительность.

Амплификация по типу катящегося кольца^[25]

Амплификация по типу катящегося кольца позволяет создавать кДНК библиотеки одиночных клеток прокариот^[26] и эукариот^[25]. Для этого РНК обратно транскрибируется, одноцепочечные кДНК разводятся до низкой концентрации (чтобы преобладали внутримолекулярные реакции), замыкаются в кольцо с помощью специальной лигазы и амплифицируются путем ПЦР с ДНК-полимеразой из бактериофага Ф29 и случайными праймерами с первой адаптерной последовательностью. Получившиеся ампликоны подвергают фрагментации для получения подходящих для секвенирования длин фрагментов и лигируют к ним второй адаптер.

Использование молекулярных штрихкодов

При подготовке библиотек для секвенирования транскриптомов одиночных клеток возникает ряд проблем, связанных с тем, что в клетках достаточно мало РНК-матрицы для синтеза кДНК. Это приводит к тому, что после множества стадий амплификации возникает искажение реального числа транкриптов в исследуемых клетках. Решением этой проблемы стали шаблон не поддерживает такой синтаксис — короткие случайные последовательности, встраиваемые в олиго(dТ)-праймер на стадии обратной транскрипции (дополнительно к баркодам, необходимым для идентификации прочтений, пришедших из одной клетки)^[27]. Дальнейший анализ проводится именно с числом различных уникальных молекулярных идентификаторов гена на клетку, а не покрытием гена.

Анализ данных

Первоочередной задачей при биоинформатическом анализе результатов секвенирования РНК одиночных клеток является получение матрицы экспрессий генов из прочтений секвенатора. После получения такой матрицы несколько направлений анализа^[28]:

Анализ на клеточном уровне: кластеризация, классификация и определение клеточных траекторий.
Анализ на уровне генов: определение дифференциально экспрессирующихся генов, регуляторных сетей.

Получение матрицы экспрессии генов

Стандартный протокол обработки прочтений, получаемых при секвенировании, включает в себя несколько шагов^[29]:

Контроль качества прочтений (FastQC).
Картирование прочтений на референсный геном (TopHat2^[30], HISAT^[31] и др.).
Подсчёт количества транскриптов исследуемых генов для каждой из клеток (используя характеристики покрытия шаблон не поддерживает такой синтаксис или число уникальных молекулярных идентификаторов).
При необходимости (например, если два набора данных были получены в разных местах и разными людьми) выполнять поправку систематической ошибки (kBET^[32]).
В случае, если использовался протокол без уникальных молекулярных идентификаторов, необходима нормализация матрицы (SCnorm^[33], SAMstrt^[34]).
Восстановление пропущенных данных (шаблон не поддерживает такой синтаксис) (MAGIC^[35], Autoimpute^[36]).

Кластеризация

С целью выявления клеточных субпопуляций обычно проводится кластеризация клеток по схожести их профилей экспрессии генов^[37]. Эта кластеризация может проводиться многими способами: методом k-средних^[38], с использованием графа ближайших соседей^[39], иерархической кластеризацией^[40] и некоторыми другими методами. Несмотря на обилие методов кластеризации данных транскриптомики одиночных клеток, она получается сразу не всегда: структура данных может скрываться за техническим шумом и систематическими ошибками^[41]^[42], также при анализе имеет место проклятие размерности. Для того, чтобы уменьшить эти эффекты, размерность транскриптомного пространства понижается различными методами.

Уменьшение размерности

Каждая клетка в анализируемой матрице экспрессий — это вектор в n-мерном пространстве, где n соответствует числу анализируемых генов, а координаты клетки — это уровни экспрессий соответствующих генов в ней^[43]. Как уже было сказано, снижение размерности может помочь восстановить структуру данных и уменьшить шумы, и потому размерность векторов экспрессий клеток необходимо понизить (при помощи метода главных компонент^[44], t-SNE^[45], многомерного шкалирования^[46], UMAP^[47] и прочих).

Дифференциальная экспрессия генов

Анализ дифференциальной экспрессии полезен для выявления дифференциально экспрессируемых генов между различными клеточными популяциями. Такие гены являются во многом характеризуют особенности изучаемых клеток и являются их маркерами^[29]. Сначала для идентификации дифференциальной экспрессии использовали инструменты, созданные для работы с транскриптомикой популяций клеток (тканей, органов); сейчас же существует ряд программ (MAST^[48], SCDE^[49]), создававшихся для поиска дифференциальной экспрессии в данных секвенирования отдельных клеток.

Генные регуляторные сети

шаблон не поддерживает такой синтаксис — это совокупность молекулярных регуляторов, взаимодействующих друг с другом и другими веществами в клетке, регулируя уровни экспрессии^[50]. Они играют центральную роль в морфогенезе и играют центральную роль в эволюционной биологии развития. Генную регуляторную сеть можно представить, в котором вершины — это гены, а рёбра — это их ко-регуляция. Существуют методы, определяющие регуляторные сети при помощи поиска корреляций между экспрессиями различных генов, однако такой подход не позволяет детектировать нелинейные взаимодействия, поэтому сейчас существует множество методов, основанных на машинном обучении^[51], вероятностных моделях^[52], а также теории информации^[53].

Поиск траекторий дифференцировок клеток

Клетки постоянно находятся в динамических процессах и реагируют на различные воздействия окружающей среды. Эти процессы сопровождаются и изменением профиля транскрипции клетки. Сама постановка эксперимента по секвенированию РНК одиночных клеток позволяет захватывать клетки в их разные стадии дифференцировки. Если промежуточных стадий отсеквенировано достаточно много, можно отследить путь дифференцировки клетки в транскриптомном пространстве в течение «псевдовремени»^[54], сейчас существует множество методов реконструкции таких траекторий^[55].

Применение

Исследования дифференцировки стволовых клеток

Отличия между отдельными клетками — фундаментальная характеристика популяций стволовых клеток, но эти отличия размываются при традиционном анализе ансамблей клеток. Одноклеточное секвенирование позволяет выявлять эти отличия и обнаруживать различные фенотипы стволовых клеток даже в пределах «однородной» популяции.

Так, были выявлены значительные различия между долгоживущими и короткоживущими гематопоэтическими стволовыми клетками мыши и определено, что основной вклад в эти различия вносят гены, отвечающие за клеточный цикл^[56]^[57]. Секвенирование РНК одиночных клеток было применено для изучения лёгких мыши^[58] и позволило найти ранее неизвестные маркеры, специфичные для различных подтипов клеток. Были также исследованы шаблон не поддерживает такой синтаксис различных видов и их траектории развития^[59]. В другом исследовании было проведено сравнение смен стадий нейронных стволовых клеток у здоровых мышей и мышей, перенёсших шаблон не поддерживает такой синтаксис^[60].

Исследования эмбриогенеза

Процесс эмбрионального развития можно рассматривать как переход от уровня отдельных клеток к уровню организма. Для изучения ранних стадий эмбрионального развития необходимы методы, способные работать с небольшим количеством доступных клеток. С помощью одноклеточного секвенирования РНК удалось провести общий анализ раннего развития млекопитающих^[61]^[62]^[63]. Были получены профили экспрессии генов для клеток человека и мыши периода предимплантационного развития^[64]^[65], а также для первичных половых клеток человека в период перехода от стадии миграции к стадии гонад^[66]. На клетках мышиных эмбрионов были изучены изменения экспрессии генов в период шаблон не поддерживает такой синтаксис^[67]^[68] (процесс замены зародышем материнских мРНК на свои собственные). Было показано, что в эмбрионе мыши активация зиготического генома происходит на стадии 4 клеток, у человека — между четырёх- и восьмиклеточной стадиями^[65]. Для нематоды c. elegans был составлен молекулярный атлас её эмбрионального развития с клеточным разрешением^[69].

Анализ тканей

Изучение транскриптома всех клеток ткани даёт возможность узнать больше о иерархии клеточных линий с непревзойдённой точностью. Параллельные исследования транскриптомики отдельных клеток селезёнки без предварительного отбора клеток, основанного на заранее выбранных клеточных маркерах, в сочетании с иерархической кластеризацией позволило воссоздать общую структуру взаимоотношений клеточных линий селезёнки^[70].

Онкологические исследования

Ткань раковой опухоли обычно состоит из нескольких популяций клеток, отличающихся друг от друга функционально и фенотипически. Согласно современным представлениям, процесс развития опухоли может иметь в своей основе не только клональную эволюцию мутировавших клеток исходной ткани, но и иерархическую дифференцировку так называемых шаблон не поддерживает такой синтаксис (РСК). Согласно концепции РСК, любое злокачественное новообразование развивается из одной клетки-предшественника популяции РСК, а опухоль устроена иерархически, то есть разные типы раковых клеток обладают разной способностью к делению^[71]. Одноклеточное секвенирование позволяет выявлять отдельные РСК, а также анализировать различные популяции клеток, находящиеся в одной опухоли.

Так, недавно были проанализированы транскриптомные профили сотен отдельных опухолевых клеток пяти пациентов с глиобластомой, что позволило выявить дифференциальную экспрессию генов, связанных с онкогенным сигнализированием, пролиферацией, комплементным и иммунным ответом и гипоксией. Также были обнаружены клетки с фенотипами, промежуточными между мезенхимальным и эпителиальным, что не соответствует классической модели эпителиально-мезенхимального перехода с двумя дискретными состояниями клеток. Кроме того, был получен набор генов «стволовости», и клетки также распределялись по непрерывной, а не дискретной шкале уровней экспрессии этих генов, что отражает сложный характер системы стволовых клеток в опухоли^[72].

На данный момент существует несколько моделей метастазирования, таких как позднее распространение, ранний сев и самосев, однако до сих пор сложно объяснить ими метастазирование в большинстве видов рака у человека. Трудности заключаются как в упомянутой выше гетерогенности клеток в пределах самой опухоли, так и в сложности анализа ключевых агентов метастазирования — шаблон не поддерживает такой синтаксис(ЦОК): эти клетки исключительно редко встречаются в крови (одна на миллион).

Тем не менее, в недавнем исследовании с помощью одноклеточного секвенирования РНК удалось выявить три различные генетические подписи в ЦОК, ассоциированные с метастазированием, у пациентов с меланомой^[73] . В другом исследовании изучалось распространение отдельных циркулирующих опухолевых клеток и их кластеров в метастатическом раке молочной железы человека, в том числе с использованием мышиных моделей. Было показано, что кластеры имеют повышенный метастатический потенциал по сравнению с отдельными ЦОК, а также что шаблон не поддерживает такой синтаксис регулирует образование таких кластеров^[74]. Исследование отдельных ЦОК метастатического рака поджелудочной железы показало, что эти клетки экспрессируют особые собственные белки внеклеточного матрикса^[75]. Подобные результаты позволяют лучше понять функционирование РСК и генетические взаимосвязи между клетками исходной опухоли и метастазов.

Отдельная тема онкологических исследований — приобретение клетками опухоли устойчивости к химиотерапии. Этот процесс также до сих пор плохо изучен для большинства видов рака у человека. В одном из последних исследований были проанализированы транскриптомные профили нескольких сотен отдельных клеток клеточной линии аденокарциномы лёгкого и выявлены новые сигнальные пути, ассоциированные с устойчивостью к определённым компонентам химиотерапии^[76]. Исследование ЦОК рака предстательной железы выявило активацию неканонического сигнального пути Wnt, способствующую устойчивости к лекарствам на основе шаблон не поддерживает такой синтаксис^[77].

Исследования альтернативного сплайсинга

Большинство генов эукариот подвержены альтернативному сплайсингу — явлению, позволяющему комбинировать экзоны гена в разных комбинациях, вследствие чего с одного гена появляется возможность производить различные транскрипты и, следовательно, различные белки с потенциально разными функциями. Несмотря на то, что некоторые методы одноклеточного секвенирования (например, SMART-Seq) имеют близкое к полному покрытие транскриптома, анализ альтернативных изоформ затруднён из-за перечисленных ранее ограничений методов. Например, транскрипты, присутствующие в малом количестве, могут быть не обнаружены из-за неотличимости от биологического шума. Однако, уже разрабатываются модели, учитывающие распределения транскриптов в объединённом множестве отдельно секвенированных клеток^[78]^[79]. Они позволят точнее предсказывать число различных изоформ в отдельных клетках.

Иммунология

Одноклеточное секвенирование может использоваться для эффективного анализа иммунного ответа клеток одной популяции, находящихся в разных условиях. Так, в недавнем исследовании изучалась динамика взаимодействия макрофагов сальмонеллы с клетками-хозяевами c различными модификациями липополисахаридов (основного компонента клеточной стенки)^[80]. В другом исследовании изучалась реакция на липополисахариды дендритных клеток костного мозга мышей^[81].

Примечания

↑ Guoji Guo, Fang Ye, Haide Chen. Revolutionizing immunology with single-cell RNA sequencing (англ.) // Cellular & Molecular Immunology. — 2019-03. — Vol. 16, iss. 3. — P. 242–249. — ISSN 2042-0226. — doi:10.1038/s41423-019-0214-4.
↑ Nicholas E. Navin. The first five years of single-cell cancer genomics and beyond (англ.) // Genome Research. — 2015-10-01. — Vol. 25, iss. 10. — P. 1499–1507. — ISSN 1549-5469 1088-9051, 1549-5469. — doi:10.1101/gr.191098.115.
↑ Patrick Cahan, Yuqi Tan, Pavithra Kumar. Understanding development and stem cells using single cell-based analyses of gene expression (англ.) // Development. — 2017-01-01. — Vol. 144, iss. 1. — P. 17–32. — ISSN 1477-9129 0950-1991, 1477-9129. — doi:10.1242/dev.133058.
↑ Minjeong Jang, Soon Woo Jeong, Nam Ho Bae, Younseong Song, Tae Jae Lee. Droplet-based digital PCR system for detection of single-cell level of foodborne pathogens (англ.) // BioChip Journal. — 2017-12-01. — Vol. 11, iss. 4. — P. 329–337. — ISSN 2092-7843. — doi:10.1007/s13206-017-1410-x.
↑ Pratip K Chattopadhyay, David A Price, Theresa F Harper, Michael R Betts, Joanne Yu. Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry (англ.) // Nature Medicine. — 2006. — Vol. 12, iss. 8. — P. 972–977. — doi:10.1038/nm1371. — PMID 16862156.
↑ Pratip K. Chattopadhyay, Mario Roederer. Cytometry: Today’s technology and tomorrow’s horizons (англ.) // Methods. — 2012. — Vol. 57, iss. 3. — P. 251–258. — doi:10.1016/j.ymeth.2012.02.009.
↑ ¹ ² Sean C Bendall, Garry P Nolan. From single cells to deep phenotypes in cancer // Nature Biotechnology. — Т. 30, вып. 7. — С. 639–647. — doi:10.1038/nbt.2283.
↑ ¹ ² Jonathan M. Irish, Randi Hovland, Peter O. Krutzik, Omar D. Perez, Oystein Bruserud. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells // Cell. — 2004. — Т. 118, вып. 2. — С. 217–228. — ISSN 0092-8674. — doi:10.1016/j.cell.2004.06.028.
↑ Andrew Filby, Esperanza Perucha, Huw Summers, Paul Rees, Prabhjoat Chana. An imaging flow cytometric method for measuring cell division history and molecular symmetry during mitosis (англ.) // Cytometry Part A. — 2011. — Vol. 79A, iss. 7. — P. 496–506. — ISSN 1552-4930. — doi:10.1002/cyto.a.21091.
↑ Keisuke Goda, Ali Ayazi, Daniel R. Gossett, Jagannath Sadasivam, Cejo K. Lonappan. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2012. — Vol. 109, iss. 29. — P. 11630–11635. — ISSN 0027-8424. — doi:10.1073/pnas.1204718109.
↑ ¹ ² R. Huber, S. Burggraf, T. Mayer, S. M. Barns, P. Rossnagel. Isolation of a hyperthermophilic archaeum predicted by in situ RNA analysis (англ.) // Nature. — 1995. — Vol. 376, iss. 6535. — P. 57–58. — doi:10.1038/376057a0.
↑ Richard Behringer, Marina Gertsenstein, Kristina Vintersten Nagy, Andras Nagy. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. — 4. — ISBN 978-1-936113-01-9.
↑ J. Frohlich, H. Konig. New techniques for isolation of single prokaryotic cells // FEMS microbiology reviews. — 2000. — Т. 24, вып. 5. — С. 567–572. — ISSN 0168-6445.
↑ Nobuo Yoshimoto, Akiko Kida, Xu Jie, Masaya Kurokawa, Masumi Iijima. An automated system for high-throughput single cell-based breeding (англ.) // Scientific Reports. — 2013. — Vol. 3, iss. 1. — ISSN 2045-2322. — doi:10.1038/srep01191.
↑ J. R. Kovac, J. Voldman. Intuitive, Image-Based Cell Sorting Using Optofluidic Cell Sorting // Analytical Chemistry. — 2007. — Т. 79, вып. 24. — С. 9321–9330. — ISSN 0003-2700. — doi:10.1021/ac071366y.
↑ Zachary C. Landry, Stephen J. Giovanonni, Stephen R. Quake, Paul C. Blainey. Chapter Four - Optofluidic Cell Selection from Complex Microbial Communities for Single-Genome Analysis // Methods in Enzymology / Edward F. DeLong. — Academic Press, 2013. — Т. 531. — С. 61–90. — doi:10.1016/b978-0-12-407863-5.00004-6.
↑ David Svec, Daniel Andersson, Milos Pekny, Robert Sjöback, Mikael Kubista. Direct Cell Lysis for Single-Cell Gene Expression Profiling // Frontiers in Oncology. — 2013-11-07. — Т. 3. — ISSN 2234-943X. — doi:10.3389/fonc.2013.00274.
↑ Carsten Rosenow, Rini Mukherjee Saxena, Mark Durst, Thomas R. Gingeras. Prokaryotic RNA preparation methods useful for high density array analysis: comparison of two approaches // Nucleic Acids Research. — 2001-11-15. — Т. 29, вып. 22. — С. e112. — ISSN 0305-1048.
↑ M G Thomas, S A Hesse, A T McKie, F Farzaneh. Sequencing of cDNA using anchored oligo dT primers. // Nucleic Acids Research. — 1993-08-11. — Т. 21, вып. 16. — С. 3915–3916. — ISSN 0305-1048.
↑ San Ming Wang, Janet D. Rowley, Jianjun Chen, Terry Clark, Clarence Wang. Oligo(dT) primer generates a high frequency of truncated cDNAs through internal poly(A) priming during reverse transcription (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2002-04-30. — Vol. 99, iss. 9. — P. 6152–6156. — ISSN 1091-6490 0027-8424, 1091-6490. — doi:10.1073/pnas.092140899.
↑ Daniel Ramsköld, Shujun Luo, Yu-Chieh Wang, Robin Li, Qiaolin Deng. Full-Length mRNA-Seq from single cell levels of RNA and individual circulating tumor cells // Nature biotechnology. — 2012-8. — Т. 30, вып. 8. — С. 777–782. — ISSN 1087-0156. — doi:10.1038/nbt.2282.
↑ Xiaoying Fan, Xiannian Zhang, Xinglong Wu, Hongshan Guo, Yuqiong Hu. Single-cell RNA-seq transcriptome analysis of linear and circular RNAs in mouse preimplantation embryos // Genome Biology. — 2015-07-23. — Т. 16, вып. 1. — С. 148. — ISSN 1465-6906. — doi:10.1186/s13059-015-0706-1.
↑ Itai Yanai, Noa Sher, Florian Wagner, Tamar Hashimshony. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification (англ.) // Cell Reports. — 2012-09-27. — Т. 2, вып. 3. — С. 666–673. — ISSN 2211-1247. — doi:10.1016/j.celrep.2012.08.003.
↑ Tamar Hashimshony, Naftalie Senderovich, Gal Avital, Agnes Klochendler, Yaron de Leeuw. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq // Genome Biology. — 2016-04-28. — Т. 17, вып. 1. — С. 77. — ISSN 1474-760X. — doi:10.1186/s13059-016-0938-8.
↑ ¹ ² Xinghua Pan, Russell E. Durrett, Haiying Zhu, Yoshiaki Tanaka, Yumei Li. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2013-01-08. — Т. 110, вып. 2. — С. 594–599. — ISSN 1091-6490. — doi:10.1073/pnas.1217322109.
↑ Yun Kang, Michael H. Norris, Jan Zarzycki-Siek, William C. Nierman, Stuart P. Donachie. Transcript amplification from single bacterium for transcriptome analysis // Genome Research. — 2011-6. — Т. 21, вып. 6. — С. 925–935. — ISSN 1549-5469. — doi:10.1101/gr.116103.110.
↑ Sten Linnarsson, Peter Lönnerberg, Maria Kasper, Pawel Zajac, Gioele La Manno. Quantitative single-cell RNA-seq with unique molecular identifiers (англ.) // Nature Methods. — 2014-02. — Vol. 11, iss. 2. — P. 163–166. — ISSN 1548-7105. — doi:10.1038/nmeth.2772.
↑ ¹ ² Duhee Bang, Ji Hyun Lee, Byungjin Hwang. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines (англ.) // Experimental & Molecular Medicine. — 2018-08-07. — Vol. 50, iss. 8. — P. 96. — ISSN 2092-6413. — doi:10.1038/s12276-018-0071-8.
↑ ¹ ² Tieliu Shi, Baitang Ning, Geng Chen. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis (англ.) // Frontiers in Genetics. — 2019. — Т. 10. — ISSN 1664-8021. — doi:10.3389/fgene.2019.00317.
↑ Daehwan Kim, Geo Pertea, Cole Trapnell, Harold Pimentel, Ryan Kelley. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions // Genome Biology. — 2013-04-25. — Т. 14, вып. 4. — С. R36. — ISSN 1474-760X. — doi:10.1186/gb-2013-14-4-r36.
↑ Steven L. Salzberg, Ben Langmead, Daehwan Kim. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements (англ.) // Nature Methods. — 2015-04. — Vol. 12, iss. 4. — P. 357–360. — ISSN 1548-7105. — doi:10.1038/nmeth.3317.
↑ Fabian J. Theis, Sarah A. Teichmann, F. Alexander Wolf, Zhichao Miao, Maren Büttner. A test metric for assessing single-cell RNA-seq batch correction (англ.) // Nature Methods. — 2019-01. — Vol. 16, iss. 1. — P. 43–49. — ISSN 1548-7105. — doi:10.1038/s41592-018-0254-1.
↑ Rhonda Bacher, Li-Fang Chu, Ning Leng, Audrey P Gasch, James A Thomson. SCnorm: robust normalization of single-cell RNA-seq data (англ.) // Nature Methods. — 2017-6. — Vol. 14, iss. 6. — P. 584–586. — ISSN 1548-7105 1548-7091, 1548-7105. — doi:10.1038/nmeth.4263.
↑ Juha Kere, Sten Linnarsson, Virpi Töhönen, Shintaro Katayama. SAMstrt: statistical test for differential expression in single-cell transcriptome with spike-in normalization (англ.) // Bioinformatics. — 2013-11-15. — Vol. 29, iss. 22. — P. 2943–2945. — ISSN 1367-4803. — doi:10.1093/bioinformatics/btt511.
↑ Dana Pe’er, Smita Krishnaswamy, Guy Wolf, Linas Mazutis, Brian Bierie. Recovering Gene Interactions from Single-Cell Data Using Data Diffusion (англ.) // Cell. — 2018-07-26. — Т. 174, вып. 3. — С. 716–729.e27. — ISSN 1097-4172 0092-8674, 1097-4172. — doi:10.1016/j.cell.2018.05.061.
↑ Angshul Majumdar, Debarka Sengupta, Aanchal Mongia, Divyanshu Talwar. AutoImpute: Autoencoder based imputation of single-cell RNA-seq data (англ.) // Scientific Reports. — 2018-11-05. — Vol. 8, iss. 1. — P. 16329. — ISSN 2045-2322. — doi:10.1038/s41598-018-34688-x.
↑ Vasilis Ntranos, Govinda M. Kamath, Jesse M. Zhang, Lior Pachter, David N. Tse. Fast and accurate single-cell RNA-seq analysis by clustering of transcript-compatibility counts // Genome Biology. — 2016-05-26. — Т. 17, вып. 1. — С. 112. — ISSN 1474-760X. — doi:10.1186/s13059-016-0970-8.
↑ Aviv Regev, Alexander F. Schier, David Gennert, Jeffrey A. Farrell, Rahul Satija. Spatial reconstruction of single-cell gene expression data (англ.) // Nature Biotechnology. — 2015-05. — Vol. 33, iss. 5. — P. 495–502. — ISSN 1546-1696. — doi:10.1038/nbt.3192.
↑ Amos Tanay, Aviezer Lifshitz, Michael Hoichman, Zohar Meir, Elad Chomsky. MetaCell: analysis of single cell RNA-seq data using k-NN graph partitions (англ.) // bioRxiv. — 2018-10-08. — P. 437665. — doi:10.1101/437665.
↑ Jesse M. Zhang, Jue Fan, H. Christina Fan, David Rosenfeld, David N. Tse. An interpretable framework for clustering single-cell RNA-Seq datasets // BMC Bioinformatics. — 2018-03-09. — Т. 19, вып. 1. — С. 93. — ISSN 1471-2105. — doi:10.1186/s12859-018-2092-7.
↑ Yoav Gilad, Jonathan K. Pritchard, Jonathan E. Burnett, David A. Knowles, Chiaowen Joyce Hsiao. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies (англ.) // Scientific Reports. — 2017-01-03. — Vol. 7. — P. 39921. — ISSN 2045-2322. — doi:10.1038/srep39921.
↑ Rafael A. Irizarry, Mingxiang Teng, F. William Townes, Stephanie C. Hicks. Missing Data and Technical Variability in Single-Cell RNA- Sequencing Experiments (англ.) // bioRxiv. — 2017-05-08. — P. 025528. — doi:10.1101/025528.
↑ Luca Pinello, Guo-Cheng Yuan, Jason D. Buenrostro, Andrei Zinovyev, David M. Langenau. Single-cell trajectories reconstruction, exploration and mapping of omics data with STREAM (англ.) // Nature Communications. — 2019-04-23. — Vol. 10, iss. 1. — P. 1903. — ISSN 2041-1723. — doi:10.1038/s41467-019-09670-4.
↑ Snehalika Lall, Debajyoti Sinha, Sanghamitra Bandyopadhyay, Debarka Sengupta. Structure-Aware Principal Component Analysis for Single-Cell RNA-seq Data // Journal of Computational Biology. — 2018-08-22. — Т. 25, вып. 12. — С. 1365–1373. — doi:10.1089/cmb.2018.0027.
↑ Philipp Berens, Dmitry Kobak. The art of using t-SNE for single-cell transcriptomics (англ.) // bioRxiv. — 2018-10-25. — P. 453449. — doi:10.1101/453449.
↑ Serafim Batzoglou, Emma Pierson, Junjie Zhu, Bo Wang. Visualization and analysis of single-cell RNA-seq data by kernel-based similarity learning (англ.) // bioRxiv. — 2016-05-09. — P. 052225. — doi:10.1101/052225.
↑ Evan W. Newell, Florent Ginhoux, Lai Guan Ng, Immanuel W. H. Kwok, Charles-Antoine Dutertre. Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP (англ.) // Nature Biotechnology. — 2019-01. — Vol. 37, iss. 1. — P. 38–44. — ISSN 1546-1696. — doi:10.1038/nbt.4314.
↑ Greg Finak, Andrew McDavid, Masanao Yajima, Jingyuan Deng, Vivian Gersuk. MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data // Genome Biology. — 2015-12-10. — Т. 16, вып. 1. — С. 278. — ISSN 1474-760X. — doi:10.1186/s13059-015-0844-5.
↑ David T. Scadden, Lev Silberstein, Peter V. Kharchenko. Bayesian approach to single-cell differential expression analysis (англ.) // Nature Methods. — 2014-07. — Vol. 11, iss. 7. — P. 740–742. — ISSN 1548-7105. — doi:10.1038/nmeth.2967.
↑ Benjamin Haibe-Kains, Matthias Dehmer, Frank Emmert-Streib. Gene regulatory networks and their applications: understanding biological and medical problems in terms of networks (англ.) // Frontiers in Cell and Developmental Biology. — 2014. — Т. 2. — ISSN 2296-634X. — doi:10.3389/fcell.2014.00038.
↑ Susumu Goto, Minoru Kanehisa, Yuki Moriya, Yoshihiro Yamanishi, Masaaki Kotera. GENIES: gene network inference engine based on supervised analysis (англ.) // Nucleic Acids Research. — 2012-07-01. — Vol. 40, iss. W1. — P. W162–W167. — ISSN 0305-1048. — doi:10.1093/nar/gks459.
↑ Wei Zhang, Seungchan Kim, Edward R. Dougherty, Ilya Shmulevich. Probabilistic Boolean networks: a rule-based uncertainty model for gene regulatory networks (англ.) // Bioinformatics. — 2002-02-01. — Vol. 18, iss. 2. — P. 261–274. — ISSN 1367-4803. — doi:10.1093/bioinformatics/18.2.261.
↑ Luonan Chen, Zhi-Ping Liu, Jin-Kao Hao, Jingdong Liu, Yongwei Cao. Inferring gene regulatory networks from gene expression data by path consistency algorithm based on conditional mutual information (англ.) // Bioinformatics. — 2012-01-01. — Vol. 28, iss. 1. — P. 98–104. — ISSN 1367-4803. — doi:10.1093/bioinformatics/btr626.
↑ John C. Marioni, Antonio Scialdone, Jonathan A. Griffiths. Using single‐cell genomics to understand developmental processes and cell fate decisions (англ.) // Molecular Systems Biology. — 2018-04-01. — Vol. 14, iss. 4. — P. e8046. — ISSN 1744-4292 1744-4292, 1744-4292. — doi:10.15252/msb.20178046.
↑ Yvan Saeys, Helena Todorov, Robrecht Cannoodt, Wouter Saelens. A comparison of single-cell trajectory inference methods (англ.) // Nature Biotechnology. — 2019-05. — Vol. 37, iss. 5. — P. 547–554. — ISSN 1546-1696. — doi:10.1038/s41587-019-0071-9.
↑ Monika S. Kowalczyk, Itay Tirosh, Dirk Heckl, Tata Nageswara Rao, Atray Dixit. Single-cell RNA-seq reveals changes in cell cycle and differentiation programs upon aging of hematopoietic stem cells (англ.) // Genome Research. — 2015. — Vol. 25, iss. 12. — P. 1860–1872. — doi:10.1101/gr.192237.115.
↑ Jason C. H. Tsang, Yong Yu, Shannon Burke, Florian Buettner, Cui Wang. Single-cell transcriptomic reconstruction reveals cell cycle and multi-lineage differentiation defects in Bcl11a -deficient hematopoietic stem cells (англ.) // Genome Biology. — 2015. — Т. 16, вып. 1. — С. 178. — doi:10.1186/s13059-015-0739-5.
↑ Barbara Treutlein, Doug G. Brownfield, Angela R. Wu, Norma F. Neff, Gary L. Mantalas. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq // Nature. — Т. 509, вып. 7500. — С. 371–375. — doi:10.1038/nature13173.
↑ Jaehoon Shin, Daniel A. Berg, Yunhua Zhu, Joseph Y. Shin, Juan Song. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis // Cell Stem Cell. — 2015. — Т. 17, вып. 3. — С. 360–372. — ISSN 1875-9777. — doi:10.1016/j.stem.2015.07.013.
↑ Enric Llorens-Bobadilla, Sheng Zhao, Avni Baser, Gonzalo Saiz-Castro, Klara Zwadlo. Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury // Cell Stem Cell. — 2015. — Т. 17, вып. 3. — С. 329–340. — ISSN 1875-9777. — doi:10.1016/j.stem.2015.07.002.
↑ Qiaolin Deng, Daniel Ramskold, Bjorn Reinius, Rickard Sandberg. Single-Cell RNA-Seq Reveals Dynamic, Random Monoallelic Gene Expression in Mammalian Cells (англ.) // Science. — 2014. — Vol. 343, iss. 6167. — P. 193–196. — doi:10.1126/science.1245316.
↑ Zhigang Xue, Kevin Huang, Chaochao Cai, Lingbo Cai, Chun-yan Jiang. Genetic programs in human and mouse early embryos revealed by single-cell RNA sequencing // Nature. — 2013. — Т. 500, вып. 7464. — С. 593–597. — ISSN 1476-4687. — doi:10.1038/nature12364.
↑ Fuchou Tang, Catalin Barbacioru, Siqin Bao, Caroline Lee, Ellen Nordman. Tracing the derivation of embryonic stem cells from the inner cell mass by single-cell RNA-Seq analysis // Cell Stem Cell. — 2010. — Т. 6, вып. 5. — С. 468–478. — ISSN 1875-9777. — doi:10.1016/j.stem.2010.03.015.
↑ Fuchou Tang, Catalin Barbacioru, Ellen Nordman, Siqin Bao, Caroline Lee. Deterministic and Stochastic Allele Specific Gene Expression in Single Mouse Blastomeres // PLOS ONE. — 2011. — Т. 6, вып. 6. — С. e21208. — ISSN 1932-6203. — doi:10.1371/journal.pone.0021208.
↑ ¹ ² Liying Yan, Mingyu Yang, Hongshan Guo, Lu Yang, Jun Wu. Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells // Nature Structural & Molecular Biology. — 2013. — Т. 20, вып. 9. — С. 1131–1139. — doi:10.1038/nsmb.2660.
↑ Fan Guo, Liying Yan, Hongshan Guo, Lin Li, Boqiang Hu. The Transcriptome and DNA Methylome Landscapes of Human Primordial Germ Cells // Cell. — 2015. — Т. 161, вып. 6. — С. 1437–1452. — ISSN 1097-4172. — doi:10.1016/j.cell.2015.05.015.
↑ Fernando H. Biase, Xiaoyi Cao, Sheng Zhong. Cell fate inclination within 2-cell and 4-cell mouse embryos revealed by single-cell RNA sequencing (англ.) // Genome Research. — 2014. — Vol. 24, iss. 11. — P. 1787–1796. — doi:10.1101/gr.177725.114.
↑ Junchao Shi, Qi Chen, Xin Li, Xiudeng Zheng, Ying Zhang. Dynamic transcriptional symmetry-breaking in pre-implantation mammalian embryo development revealed by single-cell RNA-seq (англ.) // Development. — 2015. — Vol. 142, iss. 20. — P. 3468–3477. — doi:10.1242/dev.123950.
↑ John I. Murray, Robert H. Waterston, Junhyong Kim, Cole Trapnell, Kai Tan. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution (англ.) // bioRxiv. — 2019-03-01. — P. 565549. — doi:10.1101/565549.
↑ Diego Adhemar Jaitin, Ephraim Kenigsberg, Hadas Keren-Shaul, Naama Elefant, Franziska Paul. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types // Science (New York, N.Y.). — 2014. — Т. 343, вып. 6172. — С. 776–779. — ISSN 1095-9203. — doi:10.1126/science.1247651.
↑ В центре внимания раковые стволовые клетки (рус.). elementy.ru. Дата обращения: 27 апреля 2017.
↑ Anoop P. Patel, Itay Tirosh, John J. Trombetta, Alex K. Shalek, Shawn M. Gillespie. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma // Science (New York, N.Y.). — 2014. — Т. 344, вып. 6190. — С. 1396–1401. — ISSN 1095-9203. — doi:10.1126/science.1254257.
↑ Daniel Ramskold, Shujun Luo, Yu-Chieh Wang, Robin Li, Qiaolin Deng. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells // Nature Biotechnology. — 2012. — Т. 30, вып. 8. — С. 777–782. — ISSN 1546-1696. — doi:10.1038/nbt.2282.
↑ Nicola Aceto, Aditya Bardia, David T. Miyamoto, Maria C. Donaldson, Ben S. Wittner. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis // Cell. — 2014. — Т. 158, вып. 5. — С. 1110–1122. — ISSN 1097-4172. — doi:10.1016/j.cell.2014.07.013.
↑ David T. Ting, Ben S. Wittner, Matteo Ligorio, Nicole Vincent Jordan, Ajay M. Shah. Single-cell RNA sequencing identifies extracellular matrix gene expression by pancreatic circulating tumor cells // Cell Reports. — 2014. — Т. 8, вып. 6. — С. 1905–1918. — ISSN 2211-1247. — doi:10.1016/j.celrep.2014.08.029.
↑ Ayako Suzuki, Koutatsu Matsushima, Hideki Makinoshima, Sumio Sugano, Takashi Kohno. Single-cell analysis of lung adenocarcinoma cell lines reveals diverse expression patterns of individual cells invoked by a molecular target drug treatment (англ.) // Genome Biology. — 2015. — Т. 16, вып. 1. — С. 66. — ISSN 1465-6906. — doi:10.1186/s13059-015-0636-y.
↑ David T. Miyamoto, Yu Zheng, Ben S. Wittner, Richard J. Lee, Huili Zhu. RNA-Seq of single prostate CTCs implicates noncanonical Wnt signaling in antiandrogen resistance // Science (New York, N.Y.). — 2015. — Т. 349, вып. 6254. — С. 1351–1356. — ISSN 1095-9203. — doi:10.1126/science.aab0917.
↑ Joshua D. Welch, Yin Hu, Jan F. Prins. Robust detection of alternative splicing in a population of single cells // Nucleic Acids Research. — 2016. — Т. 44, вып. 8. — С. e73. — ISSN 0305-1048. — doi:10.1093/nar/gkv1525.
↑ Georgi K. Marinov, Brian A. Williams, Ken McCue, Gary P. Schroth, Jason Gertz. From single-cell to cell-pool transcriptomes: Stochasticity in gene expression and RNA splicing // Genome Research. — 2017. — Т. 24, вып. 3. — С. 496–510. — ISSN 1088-9051. — doi:10.1101/gr.161034.113.
↑ Roi Avraham, Nathan Haseley, Douglas Brown, Cristina Penaranda, Humberto B. Jijon. Pathogen Cell-to-Cell Variability Drives Heterogeneity in Host Immune Responses (англ.) // Cell. — 2015. — Vol. 162, iss. 6. — P. 1309–1321. — ISSN 1097-4172. — doi:10.1016/j.cell.2015.08.027. — PMID 26343579.
↑ Alex K. Shalek, Rahul Satija, Xian Adiconis, Rona S. Gertner, Jellert T. Gaublomme. Single-cell transcriptomics reveals bimodality in expression and splicing in immune cells (англ.) // Nature. — 2013. — Vol. 498, iss. 7453. — P. 236–240. — ISSN 0028-0836. — doi:10.1038/nature12172.

Литература

Aleksandra A. Kolodziejczyk, Jong Kyoung Kim, Valentine Svensson, John C. Marioni, Sarah A. Teichmann. The technology and biology of single-cell RNA sequencing (англ.) // Molecular Cell. — 2015. — Vol. 58, iss. 4. — P. 610–620. — ISSN 1097-4164. — doi:10.1016/j.molcel.2015.04.005. — PMID 26000846.
E. Shapiro, T. Biezuner, S. Linnarsson. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science (англ.) // Nat Rev Genet. — 2013. — Vol. 14, no. 9. — P. 618-630. — doi:10.1038/nrg3542. — PMID 23897237.
Antoine-Emmanuel Saliba, Alexander J. Westermann, Stanislaw A. Gorski, Jorg Vogel. Single-cell RNA-seq: advances and future challenges (англ.) // Nucleic Acids Research. — 2014. — Vol. 42, iss. 14. — P. 8845–8860. — ISSN 0305-1048. — doi:10.1093/nar/gku555. — PMID 25053837.
Oliver Stegle, Sarah A. Teichmann, John C. Marioni. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics (англ.) // Nature Reviews Genetics. — 2015. — Vol. 16, iss. 3. — P. 133–145. — doi:10.1038/nrg3833. — PMID 25628217.
Lu Wen, Fuchou Tang. Single-cell sequencing in stem cell biology (англ.) // Genome Biology. — 2016. — Vol. 17. — ISSN 1474-7596. — doi:10.1186/s13059-016-0941-0. — PMID 27083874.
Assieh Saadatpour, Shujing Lai, Guoji Guo, Guo-Cheng Yuan. Single-Cell Analysis in Cancer Genomics (англ.) // Trends in genetics: TIG. — 2015. — Vol. 31, iss. 10. — P. 576–586. — ISSN 0168-9525. — doi:10.1016/j.tig.2015.07.003. — PMID 26450340.

Дополнительные ссылки

Analysis of single cell RNA-seq data ^(англ.): плей-лист (17 видео) от Bioinformatics Training — University of Cambridge
"Введение в scRNA-Seq". CompBiol.ru. Дата обращения: 30 апреля 2017.
"Анализ данных scRNA-Seq: проблемы и методы биоинформатики, часть 1". CompBiol.ru. Дата обращения: 30 апреля 2017.
Транскриптомика: практические методы и применяемые алгоритмы А. Предеус, Институт биоинформатики
Транскриптомика: анализ данных RNA-seq П. Мазин, Факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ
RNA-seqlopedia от University of Oregon (англ.). rnaseq.uoregon.edu. Дата обращения: 29 апреля 2017.

[1] Guoji Guo, Fang Ye, Haide Chen. Revolutionizing immunology with single-cell RNA sequencing (англ.) // Cellular & Molecular Immunology. — 2019-03. — Vol. 16, iss. 3. — P. 242–249. — ISSN 2042-0226. — doi:10.1038/s41423-019-0214-4.

[2] Nicholas E. Navin. The first five years of single-cell cancer genomics and beyond (англ.) // Genome Research. — 2015-10-01. — Vol. 25, iss. 10. — P. 1499–1507. — ISSN 1549-5469 1088-9051, 1549-5469. — doi:10.1101/gr.191098.115.

[3] Patrick Cahan, Yuqi Tan, Pavithra Kumar. Understanding development and stem cells using single cell-based analyses of gene expression (англ.) // Development. — 2017-01-01. — Vol. 144, iss. 1. — P. 17–32. — ISSN 1477-9129 0950-1991, 1477-9129. — doi:10.1242/dev.133058.

[4] Minjeong Jang, Soon Woo Jeong, Nam Ho Bae, Younseong Song, Tae Jae Lee. Droplet-based digital PCR system for detection of single-cell level of foodborne pathogens (англ.) // BioChip Journal. — 2017-12-01. — Vol. 11, iss. 4. — P. 329–337. — ISSN 2092-7843. — doi:10.1007/s13206-017-1410-x.

[5] Pratip K Chattopadhyay, David A Price, Theresa F Harper, Michael R Betts, Joanne Yu. Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry (англ.) // Nature Medicine. — 2006. — Vol. 12, iss. 8. — P. 972–977. — doi:10.1038/nm1371. — PMID 16862156.

[6] Pratip K. Chattopadhyay, Mario Roederer. Cytometry: Today’s technology and tomorrow’s horizons (англ.) // Methods. — 2012. — Vol. 57, iss. 3. — P. 251–258. — doi:10.1016/j.ymeth.2012.02.009.

[:0-7] ¹ ² Sean C Bendall, Garry P Nolan. From single cells to deep phenotypes in cancer // Nature Biotechnology. — Т. 30, вып. 7. — С. 639–647. — doi:10.1038/nbt.2283.

[:1-8] ¹ ² Jonathan M. Irish, Randi Hovland, Peter O. Krutzik, Omar D. Perez, Oystein Bruserud. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells // Cell. — 2004. — Т. 118, вып. 2. — С. 217–228. — ISSN 0092-8674. — doi:10.1016/j.cell.2004.06.028.

[9] Andrew Filby, Esperanza Perucha, Huw Summers, Paul Rees, Prabhjoat Chana. An imaging flow cytometric method for measuring cell division history and molecular symmetry during mitosis (англ.) // Cytometry Part A. — 2011. — Vol. 79A, iss. 7. — P. 496–506. — ISSN 1552-4930. — doi:10.1002/cyto.a.21091.

[10] Keisuke Goda, Ali Ayazi, Daniel R. Gossett, Jagannath Sadasivam, Cejo K. Lonappan. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2012. — Vol. 109, iss. 29. — P. 11630–11635. — ISSN 0027-8424. — doi:10.1073/pnas.1204718109.

[автоссылка1-11] ¹ ² R. Huber, S. Burggraf, T. Mayer, S. M. Barns, P. Rossnagel. Isolation of a hyperthermophilic archaeum predicted by in situ RNA analysis (англ.) // Nature. — 1995. — Vol. 376, iss. 6535. — P. 57–58. — doi:10.1038/376057a0.

[12] Richard Behringer, Marina Gertsenstein, Kristina Vintersten Nagy, Andras Nagy. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. — 4. — ISBN 978-1-936113-01-9.

[13] J. Frohlich, H. Konig. New techniques for isolation of single prokaryotic cells // FEMS microbiology reviews. — 2000. — Т. 24, вып. 5. — С. 567–572. — ISSN 0168-6445.

[14] Nobuo Yoshimoto, Akiko Kida, Xu Jie, Masaya Kurokawa, Masumi Iijima. An automated system for high-throughput single cell-based breeding (англ.) // Scientific Reports. — 2013. — Vol. 3, iss. 1. — ISSN 2045-2322. — doi:10.1038/srep01191.

[15] J. R. Kovac, J. Voldman. Intuitive, Image-Based Cell Sorting Using Optofluidic Cell Sorting // Analytical Chemistry. — 2007. — Т. 79, вып. 24. — С. 9321–9330. — ISSN 0003-2700. — doi:10.1021/ac071366y.

[16] Zachary C. Landry, Stephen J. Giovanonni, Stephen R. Quake, Paul C. Blainey. Chapter Four - Optofluidic Cell Selection from Complex Microbial Communities for Single-Genome Analysis // Methods in Enzymology / Edward F. DeLong. — Academic Press, 2013. — Т. 531. — С. 61–90. — doi:10.1016/b978-0-12-407863-5.00004-6.

[17] David Svec, Daniel Andersson, Milos Pekny, Robert Sjöback, Mikael Kubista. Direct Cell Lysis for Single-Cell Gene Expression Profiling // Frontiers in Oncology. — 2013-11-07. — Т. 3. — ISSN 2234-943X. — doi:10.3389/fonc.2013.00274.

[18] Carsten Rosenow, Rini Mukherjee Saxena, Mark Durst, Thomas R. Gingeras. Prokaryotic RNA preparation methods useful for high density array analysis: comparison of two approaches // Nucleic Acids Research. — 2001-11-15. — Т. 29, вып. 22. — С. e112. — ISSN 0305-1048.

[19] M G Thomas, S A Hesse, A T McKie, F Farzaneh. Sequencing of cDNA using anchored oligo dT primers. // Nucleic Acids Research. — 1993-08-11. — Т. 21, вып. 16. — С. 3915–3916. — ISSN 0305-1048.

[20] San Ming Wang, Janet D. Rowley, Jianjun Chen, Terry Clark, Clarence Wang. Oligo(dT) primer generates a high frequency of truncated cDNAs through internal poly(A) priming during reverse transcription (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2002-04-30. — Vol. 99, iss. 9. — P. 6152–6156. — ISSN 1091-6490 0027-8424, 1091-6490. — doi:10.1073/pnas.092140899.

[21] Daniel Ramsköld, Shujun Luo, Yu-Chieh Wang, Robin Li, Qiaolin Deng. Full-Length mRNA-Seq from single cell levels of RNA and individual circulating tumor cells // Nature biotechnology. — 2012-8. — Т. 30, вып. 8. — С. 777–782. — ISSN 1087-0156. — doi:10.1038/nbt.2282.

[22] Xiaoying Fan, Xiannian Zhang, Xinglong Wu, Hongshan Guo, Yuqiong Hu. Single-cell RNA-seq transcriptome analysis of linear and circular RNAs in mouse preimplantation embryos // Genome Biology. — 2015-07-23. — Т. 16, вып. 1. — С. 148. — ISSN 1465-6906. — doi:10.1186/s13059-015-0706-1.

[23] Itai Yanai, Noa Sher, Florian Wagner, Tamar Hashimshony. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification (англ.) // Cell Reports. — 2012-09-27. — Т. 2, вып. 3. — С. 666–673. — ISSN 2211-1247. — doi:10.1016/j.celrep.2012.08.003.

[24] Tamar Hashimshony, Naftalie Senderovich, Gal Avital, Agnes Klochendler, Yaron de Leeuw. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq // Genome Biology. — 2016-04-28. — Т. 17, вып. 1. — С. 77. — ISSN 1474-760X. — doi:10.1186/s13059-016-0938-8.

[:2-25] ¹ ² Xinghua Pan, Russell E. Durrett, Haiying Zhu, Yoshiaki Tanaka, Yumei Li. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2013-01-08. — Т. 110, вып. 2. — С. 594–599. — ISSN 1091-6490. — doi:10.1073/pnas.1217322109.

[26] Yun Kang, Michael H. Norris, Jan Zarzycki-Siek, William C. Nierman, Stuart P. Donachie. Transcript amplification from single bacterium for transcriptome analysis // Genome Research. — 2011-6. — Т. 21, вып. 6. — С. 925–935. — ISSN 1549-5469. — doi:10.1101/gr.116103.110.

[27] Sten Linnarsson, Peter Lönnerberg, Maria Kasper, Pawel Zajac, Gioele La Manno. Quantitative single-cell RNA-seq with unique molecular identifiers (англ.) // Nature Methods. — 2014-02. — Vol. 11, iss. 2. — P. 163–166. — ISSN 1548-7105. — doi:10.1038/nmeth.2772.

[:3-28] ¹ ² Duhee Bang, Ji Hyun Lee, Byungjin Hwang. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines (англ.) // Experimental & Molecular Medicine. — 2018-08-07. — Vol. 50, iss. 8. — P. 96. — ISSN 2092-6413. — doi:10.1038/s12276-018-0071-8.

[:4-29] ¹ ² Tieliu Shi, Baitang Ning, Geng Chen. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis (англ.) // Frontiers in Genetics. — 2019. — Т. 10. — ISSN 1664-8021. — doi:10.3389/fgene.2019.00317.

[30] Daehwan Kim, Geo Pertea, Cole Trapnell, Harold Pimentel, Ryan Kelley. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions // Genome Biology. — 2013-04-25. — Т. 14, вып. 4. — С. R36. — ISSN 1474-760X. — doi:10.1186/gb-2013-14-4-r36.

[31] Steven L. Salzberg, Ben Langmead, Daehwan Kim. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements (англ.) // Nature Methods. — 2015-04. — Vol. 12, iss. 4. — P. 357–360. — ISSN 1548-7105. — doi:10.1038/nmeth.3317.

[32] Fabian J. Theis, Sarah A. Teichmann, F. Alexander Wolf, Zhichao Miao, Maren Büttner. A test metric for assessing single-cell RNA-seq batch correction (англ.) // Nature Methods. — 2019-01. — Vol. 16, iss. 1. — P. 43–49. — ISSN 1548-7105. — doi:10.1038/s41592-018-0254-1.

[33] Rhonda Bacher, Li-Fang Chu, Ning Leng, Audrey P Gasch, James A Thomson. SCnorm: robust normalization of single-cell RNA-seq data (англ.) // Nature Methods. — 2017-6. — Vol. 14, iss. 6. — P. 584–586. — ISSN 1548-7105 1548-7091, 1548-7105. — doi:10.1038/nmeth.4263.

[34] Juha Kere, Sten Linnarsson, Virpi Töhönen, Shintaro Katayama. SAMstrt: statistical test for differential expression in single-cell transcriptome with spike-in normalization (англ.) // Bioinformatics. — 2013-11-15. — Vol. 29, iss. 22. — P. 2943–2945. — ISSN 1367-4803. — doi:10.1093/bioinformatics/btt511.

[35] Dana Pe’er, Smita Krishnaswamy, Guy Wolf, Linas Mazutis, Brian Bierie. Recovering Gene Interactions from Single-Cell Data Using Data Diffusion (англ.) // Cell. — 2018-07-26. — Т. 174, вып. 3. — С. 716–729.e27. — ISSN 1097-4172 0092-8674, 1097-4172. — doi:10.1016/j.cell.2018.05.061.

[36] Angshul Majumdar, Debarka Sengupta, Aanchal Mongia, Divyanshu Talwar. AutoImpute: Autoencoder based imputation of single-cell RNA-seq data (англ.) // Scientific Reports. — 2018-11-05. — Vol. 8, iss. 1. — P. 16329. — ISSN 2045-2322. — doi:10.1038/s41598-018-34688-x.

[37] Vasilis Ntranos, Govinda M. Kamath, Jesse M. Zhang, Lior Pachter, David N. Tse. Fast and accurate single-cell RNA-seq analysis by clustering of transcript-compatibility counts // Genome Biology. — 2016-05-26. — Т. 17, вып. 1. — С. 112. — ISSN 1474-760X. — doi:10.1186/s13059-016-0970-8.

[38] Aviv Regev, Alexander F. Schier, David Gennert, Jeffrey A. Farrell, Rahul Satija. Spatial reconstruction of single-cell gene expression data (англ.) // Nature Biotechnology. — 2015-05. — Vol. 33, iss. 5. — P. 495–502. — ISSN 1546-1696. — doi:10.1038/nbt.3192.

[39] Amos Tanay, Aviezer Lifshitz, Michael Hoichman, Zohar Meir, Elad Chomsky. MetaCell: analysis of single cell RNA-seq data using k-NN graph partitions (англ.) // bioRxiv. — 2018-10-08. — P. 437665. — doi:10.1101/437665.

[40] Jesse M. Zhang, Jue Fan, H. Christina Fan, David Rosenfeld, David N. Tse. An interpretable framework for clustering single-cell RNA-Seq datasets // BMC Bioinformatics. — 2018-03-09. — Т. 19, вып. 1. — С. 93. — ISSN 1471-2105. — doi:10.1186/s12859-018-2092-7.

[41] Yoav Gilad, Jonathan K. Pritchard, Jonathan E. Burnett, David A. Knowles, Chiaowen Joyce Hsiao. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies (англ.) // Scientific Reports. — 2017-01-03. — Vol. 7. — P. 39921. — ISSN 2045-2322. — doi:10.1038/srep39921.

[42] Rafael A. Irizarry, Mingxiang Teng, F. William Townes, Stephanie C. Hicks. Missing Data and Technical Variability in Single-Cell RNA- Sequencing Experiments (англ.) // bioRxiv. — 2017-05-08. — P. 025528. — doi:10.1101/025528.

[43] Luca Pinello, Guo-Cheng Yuan, Jason D. Buenrostro, Andrei Zinovyev, David M. Langenau. Single-cell trajectories reconstruction, exploration and mapping of omics data with STREAM (англ.) // Nature Communications. — 2019-04-23. — Vol. 10, iss. 1. — P. 1903. — ISSN 2041-1723. — doi:10.1038/s41467-019-09670-4.

[44] Snehalika Lall, Debajyoti Sinha, Sanghamitra Bandyopadhyay, Debarka Sengupta. Structure-Aware Principal Component Analysis for Single-Cell RNA-seq Data // Journal of Computational Biology. — 2018-08-22. — Т. 25, вып. 12. — С. 1365–1373. — doi:10.1089/cmb.2018.0027.

[45] Philipp Berens, Dmitry Kobak. The art of using t-SNE for single-cell transcriptomics (англ.) // bioRxiv. — 2018-10-25. — P. 453449. — doi:10.1101/453449.

[46] Serafim Batzoglou, Emma Pierson, Junjie Zhu, Bo Wang. Visualization and analysis of single-cell RNA-seq data by kernel-based similarity learning (англ.) // bioRxiv. — 2016-05-09. — P. 052225. — doi:10.1101/052225.

[47] Evan W. Newell, Florent Ginhoux, Lai Guan Ng, Immanuel W. H. Kwok, Charles-Antoine Dutertre. Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP (англ.) // Nature Biotechnology. — 2019-01. — Vol. 37, iss. 1. — P. 38–44. — ISSN 1546-1696. — doi:10.1038/nbt.4314.

[48] Greg Finak, Andrew McDavid, Masanao Yajima, Jingyuan Deng, Vivian Gersuk. MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data // Genome Biology. — 2015-12-10. — Т. 16, вып. 1. — С. 278. — ISSN 1474-760X. — doi:10.1186/s13059-015-0844-5.

[49] David T. Scadden, Lev Silberstein, Peter V. Kharchenko. Bayesian approach to single-cell differential expression analysis (англ.) // Nature Methods. — 2014-07. — Vol. 11, iss. 7. — P. 740–742. — ISSN 1548-7105. — doi:10.1038/nmeth.2967.

[50] Benjamin Haibe-Kains, Matthias Dehmer, Frank Emmert-Streib. Gene regulatory networks and their applications: understanding biological and medical problems in terms of networks (англ.) // Frontiers in Cell and Developmental Biology. — 2014. — Т. 2. — ISSN 2296-634X. — doi:10.3389/fcell.2014.00038.

[51] Susumu Goto, Minoru Kanehisa, Yuki Moriya, Yoshihiro Yamanishi, Masaaki Kotera. GENIES: gene network inference engine based on supervised analysis (англ.) // Nucleic Acids Research. — 2012-07-01. — Vol. 40, iss. W1. — P. W162–W167. — ISSN 0305-1048. — doi:10.1093/nar/gks459.

[52] Wei Zhang, Seungchan Kim, Edward R. Dougherty, Ilya Shmulevich. Probabilistic Boolean networks: a rule-based uncertainty model for gene regulatory networks (англ.) // Bioinformatics. — 2002-02-01. — Vol. 18, iss. 2. — P. 261–274. — ISSN 1367-4803. — doi:10.1093/bioinformatics/18.2.261.

[53] Luonan Chen, Zhi-Ping Liu, Jin-Kao Hao, Jingdong Liu, Yongwei Cao. Inferring gene regulatory networks from gene expression data by path consistency algorithm based on conditional mutual information (англ.) // Bioinformatics. — 2012-01-01. — Vol. 28, iss. 1. — P. 98–104. — ISSN 1367-4803. — doi:10.1093/bioinformatics/btr626.

[54] John C. Marioni, Antonio Scialdone, Jonathan A. Griffiths. Using single‐cell genomics to understand developmental processes and cell fate decisions (англ.) // Molecular Systems Biology. — 2018-04-01. — Vol. 14, iss. 4. — P. e8046. — ISSN 1744-4292 1744-4292, 1744-4292. — doi:10.15252/msb.20178046.

[55] Yvan Saeys, Helena Todorov, Robrecht Cannoodt, Wouter Saelens. A comparison of single-cell trajectory inference methods (англ.) // Nature Biotechnology. — 2019-05. — Vol. 37, iss. 5. — P. 547–554. — ISSN 1546-1696. — doi:10.1038/s41587-019-0071-9.

[56] Monika S. Kowalczyk, Itay Tirosh, Dirk Heckl, Tata Nageswara Rao, Atray Dixit. Single-cell RNA-seq reveals changes in cell cycle and differentiation programs upon aging of hematopoietic stem cells (англ.) // Genome Research. — 2015. — Vol. 25, iss. 12. — P. 1860–1872. — doi:10.1101/gr.192237.115.

[57] Jason C. H. Tsang, Yong Yu, Shannon Burke, Florian Buettner, Cui Wang. Single-cell transcriptomic reconstruction reveals cell cycle and multi-lineage differentiation defects in Bcl11a -deficient hematopoietic stem cells (англ.) // Genome Biology. — 2015. — Т. 16, вып. 1. — С. 178. — doi:10.1186/s13059-015-0739-5.

[58] Barbara Treutlein, Doug G. Brownfield, Angela R. Wu, Norma F. Neff, Gary L. Mantalas. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq // Nature. — Т. 509, вып. 7500. — С. 371–375. — doi:10.1038/nature13173.

[59] Jaehoon Shin, Daniel A. Berg, Yunhua Zhu, Joseph Y. Shin, Juan Song. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis // Cell Stem Cell. — 2015. — Т. 17, вып. 3. — С. 360–372. — ISSN 1875-9777. — doi:10.1016/j.stem.2015.07.013.

[60] Enric Llorens-Bobadilla, Sheng Zhao, Avni Baser, Gonzalo Saiz-Castro, Klara Zwadlo. Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury // Cell Stem Cell. — 2015. — Т. 17, вып. 3. — С. 329–340. — ISSN 1875-9777. — doi:10.1016/j.stem.2015.07.002.

[61] Qiaolin Deng, Daniel Ramskold, Bjorn Reinius, Rickard Sandberg. Single-Cell RNA-Seq Reveals Dynamic, Random Monoallelic Gene Expression in Mammalian Cells (англ.) // Science. — 2014. — Vol. 343, iss. 6167. — P. 193–196. — doi:10.1126/science.1245316.

[62] Zhigang Xue, Kevin Huang, Chaochao Cai, Lingbo Cai, Chun-yan Jiang. Genetic programs in human and mouse early embryos revealed by single-cell RNA sequencing // Nature. — 2013. — Т. 500, вып. 7464. — С. 593–597. — ISSN 1476-4687. — doi:10.1038/nature12364.

[63] Fuchou Tang, Catalin Barbacioru, Siqin Bao, Caroline Lee, Ellen Nordman. Tracing the derivation of embryonic stem cells from the inner cell mass by single-cell RNA-Seq analysis // Cell Stem Cell. — 2010. — Т. 6, вып. 5. — С. 468–478. — ISSN 1875-9777. — doi:10.1016/j.stem.2010.03.015.

[64] Fuchou Tang, Catalin Barbacioru, Ellen Nordman, Siqin Bao, Caroline Lee. Deterministic and Stochastic Allele Specific Gene Expression in Single Mouse Blastomeres // PLOS ONE. — 2011. — Т. 6, вып. 6. — С. e21208. — ISSN 1932-6203. — doi:10.1371/journal.pone.0021208.

[yan2013-65] ¹ ² Liying Yan, Mingyu Yang, Hongshan Guo, Lu Yang, Jun Wu. Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells // Nature Structural & Molecular Biology. — 2013. — Т. 20, вып. 9. — С. 1131–1139. — doi:10.1038/nsmb.2660.

[66] Fan Guo, Liying Yan, Hongshan Guo, Lin Li, Boqiang Hu. The Transcriptome and DNA Methylome Landscapes of Human Primordial Germ Cells // Cell. — 2015. — Т. 161, вып. 6. — С. 1437–1452. — ISSN 1097-4172. — doi:10.1016/j.cell.2015.05.015.

[67] Fernando H. Biase, Xiaoyi Cao, Sheng Zhong. Cell fate inclination within 2-cell and 4-cell mouse embryos revealed by single-cell RNA sequencing (англ.) // Genome Research. — 2014. — Vol. 24, iss. 11. — P. 1787–1796. — doi:10.1101/gr.177725.114.

[68] Junchao Shi, Qi Chen, Xin Li, Xiudeng Zheng, Ying Zhang. Dynamic transcriptional symmetry-breaking in pre-implantation mammalian embryo development revealed by single-cell RNA-seq (англ.) // Development. — 2015. — Vol. 142, iss. 20. — P. 3468–3477. — doi:10.1242/dev.123950.

[69] John I. Murray, Robert H. Waterston, Junhyong Kim, Cole Trapnell, Kai Tan. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution (англ.) // bioRxiv. — 2019-03-01. — P. 565549. — doi:10.1101/565549.

[jaitin2014-70] Diego Adhemar Jaitin, Ephraim Kenigsberg, Hadas Keren-Shaul, Naama Elefant, Franziska Paul. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types // Science (New York, N.Y.). — 2014. — Т. 343, вып. 6172. — С. 776–779. — ISSN 1095-9203. — doi:10.1126/science.1247651.

[71] В центре внимания раковые стволовые клетки (рус.). elementy.ru. Дата обращения: 27 апреля 2017.

[72] Anoop P. Patel, Itay Tirosh, John J. Trombetta, Alex K. Shalek, Shawn M. Gillespie. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma // Science (New York, N.Y.). — 2014. — Т. 344, вып. 6190. — С. 1396–1401. — ISSN 1095-9203. — doi:10.1126/science.1254257.

[73] Daniel Ramskold, Shujun Luo, Yu-Chieh Wang, Robin Li, Qiaolin Deng. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells // Nature Biotechnology. — 2012. — Т. 30, вып. 8. — С. 777–782. — ISSN 1546-1696. — doi:10.1038/nbt.2282.

[74] Nicola Aceto, Aditya Bardia, David T. Miyamoto, Maria C. Donaldson, Ben S. Wittner. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis // Cell. — 2014. — Т. 158, вып. 5. — С. 1110–1122. — ISSN 1097-4172. — doi:10.1016/j.cell.2014.07.013.

[75] David T. Ting, Ben S. Wittner, Matteo Ligorio, Nicole Vincent Jordan, Ajay M. Shah. Single-cell RNA sequencing identifies extracellular matrix gene expression by pancreatic circulating tumor cells // Cell Reports. — 2014. — Т. 8, вып. 6. — С. 1905–1918. — ISSN 2211-1247. — doi:10.1016/j.celrep.2014.08.029.

[76] Ayako Suzuki, Koutatsu Matsushima, Hideki Makinoshima, Sumio Sugano, Takashi Kohno. Single-cell analysis of lung adenocarcinoma cell lines reveals diverse expression patterns of individual cells invoked by a molecular target drug treatment (англ.) // Genome Biology. — 2015. — Т. 16, вып. 1. — С. 66. — ISSN 1465-6906. — doi:10.1186/s13059-015-0636-y.

[77] David T. Miyamoto, Yu Zheng, Ben S. Wittner, Richard J. Lee, Huili Zhu. RNA-Seq of single prostate CTCs implicates noncanonical Wnt signaling in antiandrogen resistance // Science (New York, N.Y.). — 2015. — Т. 349, вып. 6254. — С. 1351–1356. — ISSN 1095-9203. — doi:10.1126/science.aab0917.

[78] Joshua D. Welch, Yin Hu, Jan F. Prins. Robust detection of alternative splicing in a population of single cells // Nucleic Acids Research. — 2016. — Т. 44, вып. 8. — С. e73. — ISSN 0305-1048. — doi:10.1093/nar/gkv1525.

[79] Georgi K. Marinov, Brian A. Williams, Ken McCue, Gary P. Schroth, Jason Gertz. From single-cell to cell-pool transcriptomes: Stochasticity in gene expression and RNA splicing // Genome Research. — 2017. — Т. 24, вып. 3. — С. 496–510. — ISSN 1088-9051. — doi:10.1101/gr.161034.113.

[80] Roi Avraham, Nathan Haseley, Douglas Brown, Cristina Penaranda, Humberto B. Jijon. Pathogen Cell-to-Cell Variability Drives Heterogeneity in Host Immune Responses (англ.) // Cell. — 2015. — Vol. 162, iss. 6. — P. 1309–1321. — ISSN 1097-4172. — doi:10.1016/j.cell.2015.08.027. — PMID 26343579.

[81] Alex K. Shalek, Rahul Satija, Xian Adiconis, Rona S. Gertner, Jellert T. Gaublomme. Single-cell transcriptomics reveals bimodality in expression and splicing in immune cells (англ.) // Nature. — 2013. — Vol. 498, iss. 7453. — P. 236–240. — ISSN 0028-0836. — doi:10.1038/nature12172.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

[18]

[19]

[20]

[21]

[22]

[23]

[24]

[25]

[26]

[27]

[28]

[29]

[30]

[31]

[32]

[33]

[34]

[35]

[36]

[37]

[38]

[39]

[40]

[41]

[42]

[43]

[44]

[45]

[46]

[47]

[48]

[49]

[50]

[51]

[52]

[53]

[54]

[55]

[56]

[57]

[58]

[59]

[60]

[61]

[62]

[63]

[64]

[65]

[66]

[67]

[68]

[69]

[70]

[71]

[72]

[73]

[74]

[75]

[76]

[77]

[78]

[79]

[80]

[81]

@@ Строка 1: / Строка 1: @@
-'''Транскриптомика отдельных клеток''' (англ. [[:en:Single-cell analysis#Transcriptomics|single-cell transcriptomics]]) — область биологических исследований, в которой основным инструментом служат методы [[Количественный анализ экспрессии генов|количественного анализа экспрессии генов]] в индивидуальных [[клетка]]х. Эти методы сочетают в себе современные технологии [[Секвенирование РНК|секвенирования РНК]] отдельных клеток (''scRNA-Seq'' от [[Английский язык|англ.]] single-cell RNA sequencing) и последние достижения [[Микрогидродинамика|микрогидродинамики]]. Они  позволяют решить проблему «усреднённых» данных, получаемых при традиционном секвенировании массовых популяций клеток.
+'''Транскриптомика отдельных клеток''' (англ. [[:en:Single-cell analysis#Transcriptomics|single-cell transcriptomics]]) — область биологических исследований, в которой основным инструментом служат методы [[Количественный анализ экспрессии генов|количественного анализа экспрессии генов]] в индивидуальных [[клетка]]х. Эти методы сочетают в себе современные технологии [[Секвенирование РНК|секвенирования РНК]] отдельных клеток (''scRNA-Seq'' от [[Английский язык|англ.]] single-cell RNA sequencing) и последние достижения [[Микрогидродинамика|микрогидродинамики]]. Они позволяют решить проблему «усреднённых» данных, получаемых при традиционном секвенировании массовых популяций клеток.
 {| class="infobox collapsible uncollapsed plainlist"
@@ Строка 28: / Строка 28: @@
 Одноклеточное секвенирование РНК сделало возможными анализ клеточного многообразия в популяциях клеток, считавшихся ранее однородными; анализ траекторий развития клеток и моделирование динамики [[Транскрипция (биология)|транскрипционных]] процессов — и всё это в очень высоком биологическом «разрешении», недостижимом при секвенировании ансамблей клеток. Из-за этого [[Проклятие размерности|сильно возрастает размерность данных]] и, как следствие, вычислительная сложность анализа. Кроме того, несмотря на стремительное развитие, методы одноклеточного секвенирования всё ещё имеют определённые технические недостатки. В последние годы продолжают разрабатываться всё новые и новые [[Биоинформатика|биоинформатические]] методы для преодоления указанных проблем и получения более точных результатов экспериментов с отдельными клетками.
-С помощью технологий одноклеточное секвенирования РНК и методов транскриптомики уже получены важные результаты в [[Иммунология|иммунологических]], [[Эмбриология|эмбриологических]] и [[Онкология|онкологических]] исследованиях.
+С помощью технологий одноклеточное секвенирования РНК и методов транскриптомики уже получены важные результаты в [[Иммунология|иммунологических]], [[Эмбриология|эмбриологических]] и [[Онкология|онкологических]] исследованиях<ref>{{Статья|автор=Guoji Guo, Fang Ye, Haide Chen|год=2019-03|doi=10.1038/s41423-019-0214-4|issn=2042-0226|выпуск=3|язык=en|страницы=242–249|издание=Cellular & Molecular Immunology|заглавие=Revolutionizing immunology with single-cell RNA sequencing|ссылка=https://www.nature.com/articles/s41423-019-0214-4|том=16}}</ref><ref>{{Статья|автор=Nicholas E. Navin|год=2015-10-01|doi=10.1101/gr.191098.115|issn=1088-9051, 1549-5469|выпуск=10|язык=en|страницы=1499–1507|издание=Genome Research|заглавие=The first five years of single-cell cancer genomics and beyond|ссылка=http://genome.cshlp.org/content/25/10/1499|том=25}}</ref><ref>{{Статья|автор=Patrick Cahan, Yuqi Tan, Pavithra Kumar|год=2017-01-01|doi=10.1242/dev.133058|issn=0950-1991, 1477-9129|выпуск=1|язык=en|страницы=17–32|издание=Development|заглавие=Understanding development and stem cells using single cell-based analyses of gene expression|ссылка=http://dev.biologists.org/content/144/1/17|том=144}}</ref>.
+== Технология секвенирования РНК отдельных клеток ==
-[[Файл:Различные этапы исследования РНК отдельных клеток, на которых применяются методы биоинформатики.png|мини|300px|'''Различные этапы исследования РНК отдельных клеток, на которых применяются методы биоинформатики'''<br>А. Контроль качества результатов эксперимента<br>
+[[Файл:Scrna seq pipeline.png|мини|276x276пкс|Схема эксперимента секвенирования РНК одиночных клеток]]
-Б. Примеры исследования гетерогенных популяций клеток: разные клеточные типы, спектр состояний клеток в ткани, спектр состояний клеток при развитии или ином биологическом процессе<br>
+Несмотря на существенный прогресс в технологиях секвенирования, происходящий в последнее время, всё ещё достаточно трудоёмко секвенировать [[РНК]] отдельной клетки напрямую: сначала необходимо получить из неё [[Комплементарная ДНК|комплементарную ДНК]] (кДНК). Кроме того, при одноклеточном секвенировании РНК исследователь должен решить две задачи, не возникающие при секвенировании ансамблей клеток: выделение отдельной клетки и [[Амплификация (молекулярная биология)|амплификация]] очень небольшого количества РНК, содержащегося в ней. Вследствие этого, все технологии одноклеточного секвенирования имеют схожие этапы:
-В. Анализ источников и уровня шума: биологического и технического]]
+# Отдельную клетку выделяют и [[Лизис|лизируют]].
-== Технология одноклеточного секвенирования РНК ==
+# Из клетки выделяют РНК и с помощью обратной транскрипции получают кДНК с баркодами, соответствующими индивидуальным.
-Несмотря на существенный прогресс в технологиях секвенирования, происходящий в последнее время, всё ещё невозможно секвенировать [[РНК]] отдельной клетки напрямую: сначала необходимо получить из неё [[Комплементарная ДНК|комплементарную ДНК]] (кДНК). Кроме того, при одноклеточном секвенировании РНК исследователь должен решить две задачи, не возникающие при секвенировании ансамблей клеток: выделение отдельной клетки и [[Амплификация (молекулярная биология)|амплификация]] очень небольшого количества РНК, содержащегося в ней. Вследствие этого, все технологии одноклеточного секвенирования имеют схожие этапы:
-# Отдельную клетку выделяют и [[Лизис|лизируют]]
-# Из клетки выделяют РНК и с помощью обратной транскрипции получают кДНК
 # Полученное малое количество кДНК амплифицируют путём [[Полимеразная цепная реакция|полимеразной цепной реакции]] (ПЦР) или [[in vitro]] [[Транскрипция (биология)|транскрипции]].
 # Амплифицированную кДНК используют для подготовки [[Геномная библиотека|библиотек]] и секвенирования.
 === Выделение отдельных клеток ===
-[[Файл:Сортировка флуоресцентно активированных клеток. Общая схема.png|thumb|300px|'''Сортировка флуоресцентно активированных клеток. Общая схема'''<br>Поток капель, каждая из которых содержит единственную клетку, проходит через возбуждающий [[лазер]]ный луч. [[Флуоресцентная микроскопия|Флуоресцентный сигнал]], исходящий от каждый клетки, анализируется мультиспектральным детектором. После этого отклоняющие пластины создают [[электростатическое поле]], направляющее клетку в нужную пробирку в зависимости от проанализированного сигнала.|альт=]]
+[[Файл:Сортировка флуоресцентно активированных клеток. Общая схема.png|thumb|277x277px|'''Сортировка флуоресцентно активированных клеток. Общая схема'''<br>Поток капель, каждая из которых содержит единственную клетку, проходит через возбуждающий [[лазер]]ный луч. [[Флуоресцентная микроскопия|Флуоресцентный сигнал]], исходящий от каждый клетки, анализируется мультиспектральным детектором. После этого отклоняющие пластины создают [[электростатическое поле]], направляющее клетку в нужную пробирку в зависимости от проанализированного сигнала.|альт=]]
-; Сортировка флуоресцентно активированных клеток
+==== Сортировка флуоресцентно активированных клеток ====
 {{main|Сортировка флуоресцентно активированных клеток|:en:Flow cytometry#Fluorescence-activated cell sorting (FACS)|l2=Fluorescence-activated cell sorting (FACS){{sup|(англ.)}} }}
+[[Файл:Микрогидродинамические методы работы с отдельными клетками.png|thumb|488x488px|'''Два примера микрогидродинамических методов'''<br>''Устройство для цифровой ПЦР отдельных клеток объединяет все шаги анализа экспрессии генов''<ref>{{Статья|автор=Minjeong Jang, Soon Woo Jeong, Nam Ho Bae, Younseong Song, Tae Jae Lee|год=2017-12-01|doi=10.1007/s13206-017-1410-x|issn=2092-7843|выпуск=4|язык=en|страницы=329–337|издание=BioChip Journal|заглавие=Droplet-based digital PCR system for detection of single-cell level of foodborne pathogens|ссылка=https://doi.org/10.1007/s13206-017-1410-x|том=11}}</ref>'':'' <br>1) каждая клетка помещается в отдельную микрокамеру (клетки указаны стрелками); <br>2) клетки по отдельности лизируются и обратно транскрибируются; <br>3) над каждой клеткой производится цифровая ПЦР.<br><br>''Микрожидкостная система отбора редких раковых клеток:'' <br>1) цельная кровь очищается от эритроцитов путём сортировки по размеру клетки; <br>2) редкие раковые клетки выделяются с помощью магнитофореза.]]
-[[Файл:Микрогидродинамические методы работы с отдельными клетками.png|thumb|300px|'''Два примера микрогидродинамических методов'''<br>
-''Устройство для цифровой ПЦР отдельных клеток объединяет все шаги анализа экспрессии генов:'' <br>
-) каждая клетка помещается в отдельную микрокамеру (клетки указаны стрелками); <br>
-) клетки по отдельности лизируются и обратно транскрибируются; <br>
-) над каждой клеткой производится цифровая ПЦР.<br>
-<br>
-''Микрожидкостная система отбора редких раковых клеток:'' <br>
-) цельная кровь очищается от эритроцитов путём сортировки по размеру клетки; <br>
-) редкие раковые клетки выделяются с помощью магнитофореза.]]
 Этот метод комбинирует многопараметрическую [[Проточная цитометрия|проточную цитометрию]] и сортировку при помощи заранее заданной стратегии флуоресцентного стробирования. [[Флуоресценция в биологических исследованиях#Флуоресцентные метки|Флуоресцентно меченные]] [[антитела]] используются для отделения интересующих нас клеток в соответствии с целевыми поверхностными маркерами. На данный момент одновременно можно использовать до 17 антител<ref>{{Статья|автор=Pratip K Chattopadhyay, David A Price, Theresa F Harper, Michael R Betts, Joanne Yu|заглавие=Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry|ссылка=http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nm1371|язык=en|издание=Nature Medicine|год=2006|том=12|выпуск=8|страницы=972–977|issn=|doi=10.1038/nm1371|pmid=16862156|url-access=subscription}}</ref><ref>{{Статья|автор=Pratip K. Chattopadhyay, Mario Roederer|заглавие=Cytometry: Today’s technology and tomorrow’s horizons|ссылка=http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1046202312000333|язык=en|издание=Methods|год=2012|том=57|выпуск=3|страницы=251–258|issn=|doi=10.1016/j.ymeth.2012.02.009}}</ref>, что даёт возможность проводить продвинутое [[иммунофенотипирование]], позволяющее определить интересные подмножества клеток даже в ранее изученных популяциях.
 Другой вариант проточной цитометрии использует антитела к различным внутриклеточным белкам и отбирает клетки в зависимости от сигнала<ref name=":0">{{Статья|автор=Sean C Bendall, Garry P Nolan|заглавие=From single cells to deep phenotypes in cancer|ссылка=http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nbt.2283|издание=Nature Biotechnology|том=30|выпуск=7|страницы=639–647|doi=10.1038/nbt.2283}}</ref><ref name=":1">{{Статья|автор=Jonathan M. Irish, Randi Hovland, Peter O. Krutzik, Omar D. Perez, Oystein Bruserud|заглавие=Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15260991|издание=Cell|год=2004|том=118|выпуск=2|страницы=217–228|issn=0092-8674|doi=10.1016/j.cell.2004.06.028}}</ref>. Этот метод требует [[Фиксация в микроскопии|фиксации]] и [[Пермеабилизация|пермеабилизации]] клеток<ref name=":0" /><ref name=":1" />, что может усложнить последующий транскриптомный анализ.
-'''Ограничения метода:'''
+Ограничения метода''':'''
-* Необходимы антитела к интересующим белкам
+* Необходимы антитела к интересующим белкам.
-* Не может обрабатывать образцы крайне малых объёмов (несколько микролитров)
+* Не может обрабатывать образцы крайне малых объёмов (несколько микролитров).
-* Не подходит для анализа крайне редких клеток (одна интересующая нас клетка на миллион)
+* Не подходит для анализа крайне редких клеток (одна интересующая нас клетка на миллион).
-* Не подходит для анализа клеток значительно отличающихся размеров
+* Не подходит для анализа клеток значительно отличающихся размеров.
-* Существующие на данный момент реализации не способны совмещать фотографирование и сортировку, препятствуя морфологическому анализу, но это может измениться в будущем<ref>{{Статья|автор=Andrew Filby, Esperanza Perucha, Huw Summers, Paul Rees, Prabhjoat Chana|заглавие=An imaging flow cytometric method for measuring cell division history and molecular symmetry during mitosis|ссылка=http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cyto.a.21091/abstract|язык=en|издание=Cytometry Part A|год=2011|том=79A|выпуск=7|страницы=496–506|issn=1552-4930|doi=10.1002/cyto.a.21091}}</ref><ref>{{Статья|автор=Keisuke Goda, Ali Ayazi, Daniel R. Gossett, Jagannath Sadasivam, Cejo K. Lonappan|заглавие=High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer|ссылка=http://www.pnas.org/content/109/29/11630|язык=en|издание=Proceedings of the National Academy of Sciences|год=2012|том=109|выпуск=29|страницы=11630–11635|issn=0027-8424|doi=10.1073/pnas.1204718109}}</ref>
+* Существующие на данный момент реализации не способны совмещать фотографирование и сортировку, препятствуя морфологическому анализу, но это может измениться в будущем<ref>{{Статья|автор=Andrew Filby, Esperanza Perucha, Huw Summers, Paul Rees, Prabhjoat Chana|заглавие=An imaging flow cytometric method for measuring cell division history and molecular symmetry during mitosis|ссылка=http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cyto.a.21091/abstract|язык=en|издание=Cytometry Part A|год=2011|том=79A|выпуск=7|страницы=496–506|issn=1552-4930|doi=10.1002/cyto.a.21091}}</ref><ref>{{Статья|автор=Keisuke Goda, Ali Ayazi, Daniel R. Gossett, Jagannath Sadasivam, Cejo K. Lonappan|заглавие=High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer|ссылка=http://www.pnas.org/content/109/29/11630|язык=en|издание=Proceedings of the National Academy of Sciences|год=2012|том=109|выпуск=29|страницы=11630–11635|issn=0027-8424|doi=10.1073/pnas.1204718109}}</ref>.
-; Микроманипуляция
+==== Микроманипуляция ====
 Стеклянная микропипетка используется для отделения одной клетки из популяции под микроскопом. Микроманипуляция была успешно применена для выборки отдельных нейронов из первичной культуры<ref name="автоссылка1">{{Статья|автор=R. Huber, S. Burggraf, T. Mayer, S. M. Barns, P. Rossnagel|заглавие=Isolation of a hyperthermophilic archaeum predicted by in situ RNA analysis|ссылка=http://www.nature.com/nature/journal/v376/n6535/abs/376057a0.html|язык=en|издание=Nature|год=1995|том=376|выпуск=6535|страницы=57–58|doi=10.1038/376057a0}}</ref>, отдельных клеток из эмбрионов различных стадий развития<ref>{{Книга|автор=Richard Behringer, Marina Gertsenstein, Kristina Vintersten Nagy, Andras Nagy|заглавие=Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual|ответственный=|издание=4|место=|издательство=|год=|страницы=|isbn=978-1-936113-01-9|isbn2=}}</ref> и бактерий<ref>{{Статья|автор=J. Frohlich, H. Konig|заглавие=New techniques for isolation of single prokaryotic cells|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11077150|издание=FEMS microbiology reviews|год=2000|том=24|выпуск=5|страницы=567–572|issn=0168-6445}}</ref>.
-'''Ограничения метода:'''
+Ограничения метода''':'''
-* Клетки отбираются вручную, это трудоёмкая процедура
+* Клетки отбираются вручную, это трудоёмкая процедура.
-* Небольшая скорость обработки клеток (несколько клеток в час)
+* Небольшая скорость обработки клеток (несколько клеток в час).
-* Не может обрабатывать образцы крайне малых объёмов
+* Не может обрабатывать образцы крайне малых объёмов.
-; Оптический пинцет
+==== Оптический пинцет ====
 Оптический пинцет использует сильно сфокусированный [[лазер]] для удержания и перемещения микроскопических диэлектрических объектов. В сочетании с отбором, основанным на фотографии, оптический пинцет может захватывать и манипулировать отдельными клетками в суспензии<ref name="автоссылка1" /> или в массиве внутри микрожидкостного устройства<ref>{{Статья|автор=Nobuo Yoshimoto, Akiko Kida, Xu Jie, Masaya Kurokawa, Masumi Iijima|заглавие=An automated system for high-throughput single cell-based breeding|ссылка=http://www.nature.com/articles/srep01191|язык=en|издание=Scientific Reports|год=2013|том=3|выпуск=1|issn=2045-2322|doi=10.1038/srep01191}}</ref><ref>{{Статья|автор=J. R. Kovac, J. Voldman|заглавие=Intuitive, Image-Based Cell Sorting Using Optofluidic Cell Sorting|ссылка=https://dx.doi.org/10.1021/ac071366y|издание=Analytical Chemistry|год=2007|том=79|выпуск=24|страницы=9321–9330|issn=0003-2700|doi=10.1021/ac071366y}}</ref><ref>{{Статья|автор=Zachary C. Landry, Stephen J. Giovanonni, Stephen R. Quake, Paul C. Blainey|заглавие=Chapter Four - Optofluidic Cell Selection from Complex Microbial Communities for Single-Genome Analysis|ссылка=http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780124078635000046|ответственный=Edward F. DeLong|издание=Methods in Enzymology|издательство=Academic Press|год=2013|том=531|страницы=61–90|doi=10.1016/b978-0-12-407863-5.00004-6}}</ref>.
-'''Ограничения метода:'''
+Ограничения метода''':'''
-* Требует продвинутого оптического оборудования
+* Требует продвинутого оптического оборудования.
-=== Лизис отдельных клеток и получение кДНК ===
+=== Лизис клеток ===
+Эукариотические клетки обычно лизируют в гипотоническом растворе. [[Осмос|Осмотический]] дисбаланс приводит к избыточному поступлению воды в клетку, разрыву ее мембраны и выходу наружу клеточного содержимого. В зависимости от выделяемой субстанции (РНК, ДНК, белок) лизирующие буферы содержат дополнительные компоненты: так, в РНК-лизирующий буфер обычно добавляют белок-денатурирующие агенты (например, {{Не переведено|:en:Guanidinium thiocyanate|GITC|GITC}}), что помогает защитить РНК от деградации РНКазами<ref>{{Статья|автор=David Svec, Daniel Andersson, Milos Pekny, Robert Sjöback, Mikael Kubista|год=2013-11-07|doi=10.3389/fonc.2013.00274|issn=2234-943X|издание=Frontiers in Oncology|заглавие=Direct Cell Lysis for Single-Cell Gene Expression Profiling|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3819639/|том=3}}</ref>.[[Файл:Схема методов амплификации РНК, применяемых в одноклеточном секвенировании.png|мини|365x365пкс|Схема методов подготовки библиотек кДНК, применяемых в одноклеточном секвенировании|альт=|слева]]
-Эукариотические клетки обычно лизируются в гипотоническом растворе (буфере), содержащим растворитель. В клетке содержится много разных молекул РНК, и в результате хотелось бы определить их все, за исключением [[тРНК]] и [[Рибосомные рибонуклеиновые кислоты|рРНК]], на которые придётся более 90 % всех ридов, если их не убрать. Поэтому большинство методов выборочно обратно транскрибируют только [[Полиаденилирование|полиаденилированные]] молекулы РНК , используя поли([[Дезокситимидин|дТ]]) праймер, что позволяет работать с наиболее интересными транскриптами, такими как мРНК и большинством [[Длинные некодирующие РНК|длинных некодирующих РНК]], длнкРНК. Тем не менее, эта стратегия не позволяет секвенировать неполиаденилированные длнкРНК и ограничена эукариотическими клетками.
+=== Получение и амплификация кДНК ===
+{{Main|Полимеразная цепная реакция|Полимеразная цепная реакция в реальном времени}}
+После выделения РНК необходимо получить из нее [[Комплементарная ДНК|комплементарную ДНК]] (кДНК) с помощью обратной транскрипции. Первая цепь кДНК синтезируется при помощи специально спроектированной версии [[Обратная транскриптаза|обратной транскриптазы]] вируса лейкемии мышей {{Не переведено|:en:M-MuLV|M-MuLV|M-MuLV}}. При синтезе первой цепи важно избавиться от мало интересующих нас [[Рибосомные рибонуклеиновые кислоты|рРНК]] и [[Транспортные рибонуклеиновые кислоты|тРНК]], которые составляют до 95% выделенной тотальной РНК клетки<ref>{{Статья|автор=Carsten Rosenow, Rini Mukherjee Saxena, Mark Durst, Thomas R. Gingeras|год=2001-11-15|issn=0305-1048|выпуск=22|страницы=e112|издание=Nucleic Acids Research|заглавие=Prokaryotic RNA preparation methods useful for high density array analysis: comparison of two approaches|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC92579/|том=29}}</ref>. Поэтому в большинстве методов выборочно обратно транскрибируют только [[Полиаденилирование|полиаденилированные]] молекулы РНК , используя поли(dT)-праймер, что позволяет работать с наиболее интересными транскриптами, такими как мРНК и большинством [[Длинные некодирующие РНК|длинных некодирующих РНК]] (длнкРНК).
+==== Обратная транскрипция с олиго(dT)-праймеров ====
-Первая цепь кДНК синтезируется при помощи специально спроектированной версии [[Обратная транскриптаза|обратной транскриптазы]] {{Не переведено|:en:Murine leukemia virus|Вирус лейкемии мышей|вируса лейкемии мышей M-MuLV}}. Для получения второй цепи существует множество протоколов, основанных на трёх основных методах: ПЦР амплификация, транскрипция in vitro и амплификация по типу катящегося кольца.
+В простейшем случае cначала проводится отбор полиаденилированных РНК и синтез первой цепи кДНК с помощью поли(dT)-праймера (часто с адаптерной последовательностью). Непрореагировавшие праймеры и dNTP удаляют с помощью смеси [[экзонуклеазы]] и [[Щелочная фосфатаза|щелочной фосфатазы]]. Затем с помощью [[ДНК-полимераза#Семейство X|концевой дезоксинуклеотидил-трансферазы]] в среде, содержащей только один тип dNTP (dA), на 3'-конец синтезированной первой цепи кДНК навешивается дополнительный поли(А)-хвост примерно в 30 нуклеотидов. С помощью поли(dT) с другой заякоривающей последовательностью синтезируется вторая цепь и полученная двуцепочечная кДНК амплифицируется путем ПЦР<ref>{{Статья|автор=M G Thomas, S A Hesse, A T McKie, F Farzaneh|год=1993-08-11|issn=0305-1048|выпуск=16|страницы=3915–3916|издание=Nucleic Acids Research|заглавие=Sequencing of cDNA using anchored oligo dT primers.|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC309939/|том=21}}</ref>.
+У этого подхода есть два основных недостатка. Из-за склонности ревертазы к раннему прерыванию 5’-конец имеет значительно меньшее покрытие. Кроме того, после добавления поли(А)-хвоста к 3’-концу кДНК вдобавок к обычному поли(А)-хвосту на 3’ конце РНК (то есть на 5' конце соответствующей кДНК) становится невозможно понять, с какой цепи ДНК эта РНК была изначально транскрибирована<ref>{{Статья|автор=San Ming Wang, Janet D. Rowley, Jianjun Chen, Terry Clark, Clarence Wang|год=2002-04-30|doi=10.1073/pnas.092140899|issn=0027-8424, 1091-6490|выпуск=9|язык=en|страницы=6152–6156|издание=Proceedings of the National Academy of Sciences|заглавие=Oligo(dT) primer generates a high frequency of truncated cDNAs through internal poly(A) priming during reverse transcription|ссылка=https://www.pnas.org/content/99/9/6152|том=99}}</ref>.
-=== Амплификация кДНК ===
-; ПЦР амплификация
-{{Main|Полимеразная цепная реакция|Полимеразная цепная реакция в реальном времени}}
-[[Файл:Схема методов амплификации РНК, применяемых в одноклеточном секвенировании.png|мини|365x365пкс|Схема методов амплификации РНК, применяемых в одноклеточном секвенировании]]
-Метод заключается в добавлении универсального [[праймер]]а к [[Дезоксирибонуклеиновая кислота#Двойная спираль|5’ концу]] после гомополимерного хвоста или {{Не переведено|:en:Template switching polymerase chain reaction|Полимеразная цепная реакция с переключением матрицы|области переключения матрицы}}. Для добавления гомополимерного хвоста длиной примерно в 30 нуклеотидов поли(А) к 3’ концу первой цепи кДНК используется [[ДНК-полимераза#Семейство X|концевая дезоксинуклеотидил-трансфераза]]. У этого подхода есть два основных недостатка. Из-за склонности [[Обратная транскриптаза|ревертазы]] к раннему прерыванию 5’ конец имеет значительно меньшее покрытие. Кроме того, после добавления поли(А) хвоста к 3’ концу кДНК вдобавок к [[Полиаденилирование|обычному поли(А) хвосту на 3’ конце РНК]] (то есть на 5' конце соответствующей кДНК) становится невозможно понять, с какой цепи ДНК эта РНК была изначально транскрибирована.
+==== Механизм смены матрицы SMART-seq<ref>{{Статья|автор=Daniel Ramsköld, Shujun Luo, Yu-Chieh Wang, Robin Li, Qiaolin Deng|год=2012-8|doi=10.1038/nbt.2282|issn=1087-0156|выпуск=8|страницы=777–782|издание=Nature biotechnology|заглавие=Full-Length mRNA-Seq from single cell levels of RNA and individual circulating tumor cells|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3467340/|том=30}}</ref> ====
-Чтобы получить однородное покрытие транскриптов был придуман механизм смены матрицы SMART-seq. Этот метод использует свойство ревертазы M-MuLV добавлять 3-4 [[цитозин]]а на 3’ конце кДНК, и эта последовательность используется в качестве якоря для универсального праймера ПЦР. В результате амплифицируются только целые транскрипты, и информация об исходной цепи не теряется за счёт добавленных цитозинов. Однако этот метод обладает меньшей чувствительностью, чем добавление гомополимерного хвоста<ref>{{Статья|автор=Aaron M. Streets, Xiannian Zhang, Chen Cao, Yuhong Pang, Xinglong Wu|заглавие=Microfluidic single-cell whole-transcriptome sequencing|ссылка=http://www.pnas.org/content/111/19/7048|язык=en|издание=Proceedings of the National Academy of Sciences|год=2014|том=111|выпуск=19|страницы=7048–7053|doi=10.1073/pnas.1402030111}}</ref>.
+Чтобы получить однородное покрытие транскриптов был придуман механизм смены матрицы SMART-seq. Этот метод использует свойство ревертазы M-MuLV добавлять 3-4 [[Цитозин|цитозина]] на 3’-конце кДНК.
+После синтеза первой цепи кДНК на матрице РНК добавляют универсальный ПЦР-праймер для смены матрицы с поли(G) и заякоривающей последовательностью. Он отжигается только на полноразмерные кДНК с цитозинами на конце, на 3’-конце которых благодаря этому достраивается заякоривающая последовательность. Затем проводят деградацию РНК, синтез второй цепи кДНК с праймером к заякоривающей последовательности и ПЦР-амплификацию. В результате амплифицируются только целые транскрипты, и информация об исходной цепи не теряется за счёт добавленных цитозинов. Однако этот метод обладает меньшей чувствительностью, чем добавление гомополимерного хвоста.
-; Транскрипция ''in vitro''
+[[Файл:Super-seq.png|мини|508x508пкс|Схема эксперимента SUPeR-seq]]
-Транскрипция in vitro амплифицирует РНК линейно при помощи {{Не переведено|:en:T7 RNA polymerase|РНК-полимераза T7|РНК-полимеразы T7}}. Этот метод лучше работает с 3’ концом исходного транскрипта<ref name=":2">{{Статья|автор=Jacqueline Morris, Jennifer M. Singh, James H. Eberwine|заглавие=Transcriptome Analysis of Single Cells|ссылка=https://www.jove.com/video/2634/transcriptome-analysis-of-single-cells|язык=en|издание=Journal of Visualized Experiments|год=2011|выпуск=50|issn=1940-087X|doi=10.3791/2634}}</ref>, и каждый раунд амплификации приводит к укорачиванию транскрипта во время синтеза второй цепи<ref name=":2" />.
+==== SUPeR-seq<ref>{{Статья|автор=Xiaoying Fan, Xiannian Zhang, Xinglong Wu, Hongshan Guo, Yuqiong Hu|год=2015-07-23|doi=10.1186/s13059-015-0706-1|issn=1465-6906|выпуск=1|страницы=148|издание=Genome Biology|заглавие=Single-cell RNA-seq transcriptome analysis of linear and circular RNAs in mouse preimplantation embryos|ссылка=https://doi.org/10.1186/s13059-015-0706-1|том=16}}</ref> ====
-; Амплификация по типу катящегося кольца
+Перечисленные выше подходы с использованием поли(dТ), однако, не позволяют секвенировать неполиаденилированные длнкРНК и кольцевые РНК, а также ограничены эукариотическими клетками. Разработаны альтернативные методы, позволяющие обратно транскрибировать как полиаденилированную, так и неполиаденилированную РНК, например SUPeR-seq.
+В SUPeR-seq получение первой комплементарной цепи проводят с помощью праймера, 3'-конец которого представляет собой случайную последовательность, а 5'-конец — поли(dT) с заякоривающей последовательностью. Синтез второй цепи проводят по методу гомополимерного хвоста. Несмотря на отсутствие каких-либо специфических этапов очистки от рибосомальной РНК, SUPeR-seq дает достаточно качественный итоговый продукт амплификации, в котором только 1.5% прочтений [[Картирование коротких прочтений|картируются]] на последовательности рРНК. Предполагается, что ограниченное количество материала, полученное только из одной клетки, а также некоторые особенности лизиса и обратной транскрипции, используемые в этом методе, не позволяют раскрываться сложной вторичной структуре рРНК, что не дает ей транскрибироваться.
+==== Транскрипция ''in vitro'' (CEL-seq)<ref>{{Статья|автор=Itai Yanai, Noa Sher, Florian Wagner, Tamar Hashimshony|год=2012-09-27|doi=10.1016/j.celrep.2012.08.003|issn=2211-1247|выпуск=3|язык=English|страницы=666–673|издание=Cell Reports|заглавие=CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification|ссылка=https://www.cell.com/cell-reports/abstract/S2211-1247(12)00228-8|том=2}}</ref> ====
+В CEL-seq применяется поли(dТ)-праймер со специальным адаптером, баркодом и встроенным промотором Т7. Синтезириованные первые цепи кДНК отбирают на колонке при помощи первого адаптера, а затем амплифицируют путем ''in vitro'' транскрипции. Амплифицированная РНК фрагментируется на куски подходящего для секвенирования размера, к 3’-концам лигируется второй адаптер, а затем РНК конвертируется в кДНК путем обратной транскрипции. кДНК, содержащие оба адаптора, отбираются и амплифицируются с помощью ПЦР.
+Этот метод позволяет амплифицировать РНК линейно, а также избежать необходимости смены матрицы, однако он лучше работает с 3’-концом исходного транскрипта, и каждый раунд амплификации приводит к укорачиванию транскрипта во время синтеза второй цепи.
+Существует вариация метода — CEL-seq2<ref>{{Статья|автор=Tamar Hashimshony, Naftalie Senderovich, Gal Avital, Agnes Klochendler, Yaron de Leeuw|год=2016-04-28|doi=10.1186/s13059-016-0938-8|issn=1474-760X|выпуск=1|страницы=77|издание=Genome Biology|заглавие=CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq|ссылка=https://doi.org/10.1186/s13059-016-0938-8|том=17}}</ref> — в которой после ''in vitro'' транскрипции проводят дополнительный этап обратной транскрипции амплифицированных РНК, что позволяет улучшить чувствительность.
+==== Амплификация по типу катящегося кольца<ref name=":2">{{Статья|автор=Xinghua Pan, Russell E. Durrett, Haiying Zhu, Yoshiaki Tanaka, Yumei Li|год=2013-01-08|doi=10.1073/pnas.1217322109|issn=1091-6490|выпуск=2|страницы=594–599|издание=Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America|заглавие=Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23267071|том=110}}</ref> ====
 {{См. также|Репликация по типу катящегося кольца}}
-Эта стратегия позволяет создавать кДНК библиотеки одиночных клеток прокариот<ref>{{Статья|автор=Yun Kang, Michael H. Norris, Jan Zarzycki-Siek, William C. Nierman, Stuart P. Donachie|заглавие=Transcript amplification from single bacterium for transcriptome analysis|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21536723|издание=Genome Research|год=2011|том=21|выпуск=6|страницы=925–935|issn=1549-5469|doi=10.1101/gr.116103.110}}</ref> и эукариот<ref>{{Статья|автор=Xinghua Pan, Russell E. Durrett, Haiying Zhu, Yoshiaki Tanaka, Yumei Li|заглавие=Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23267071|издание=Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America|год=2013|том=110|выпуск=2|страницы=594–599|issn=1091-6490|doi=10.1073/pnas.1217322109}}</ref>. Для этого РНК обратно транскрибируется, замыкается в кольцо и амплифицируется при помощи {{не переведено|:en:Φ29 DNA polymerase|ДНК-полимераза Φ29|ДНК-полимеразы Φ29}}, что позволяет сохранить полное покрытие транскриптов.
+Амплификация по типу катящегося кольца позволяет создавать кДНК библиотеки одиночных клеток прокариот<ref>{{Статья|автор=Yun Kang, Michael H. Norris, Jan Zarzycki-Siek, William C. Nierman, Stuart P. Donachie|год=2011-6|doi=10.1101/gr.116103.110|issn=1549-5469|выпуск=6|страницы=925–935|издание=Genome Research|заглавие=Transcript amplification from single bacterium for transcriptome analysis|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21536723|том=21}}</ref> и эукариот<ref name=":2" />. Для этого РНК обратно транскрибируется, одноцепочечные кДНК разводятся до низкой концентрации (чтобы преобладали внутримолекулярные реакции), замыкаются в кольцо с помощью специальной [[лигазы]] и амплифицируются путем ПЦР с ДНК-полимеразой из бактериофага Ф29 и случайными праймерами с первой адаптерной последовательностью. Получившиеся ампликоны подвергают фрагментации для получения подходящих для секвенирования длин фрагментов и лигируют к ним второй адаптер.
 === Использование молекулярных штрихкодов ===
+При подготовке библиотек для секвенирования транскриптомов одиночных клеток возникает ряд проблем, связанных с тем, что в клетках достаточно мало РНК-матрицы для синтеза кДНК. Это приводит к тому, что после множества стадий амплификации возникает искажение реального числа транкриптов в исследуемых клетках. Решением этой проблемы стали {{Не переведено|:en:Unique molecular identifier|Уникальный молекулярный идентификатор|уникальные молекулярные идентификаторы}} — короткие случайные последовательности, встраиваемые в олиго(dТ)-праймер на стадии обратной транскрипции (дополнительно к баркодам, необходимым для идентификации прочтений, пришедших из одной клетки)<ref>{{Статья|автор=Sten Linnarsson, Peter Lönnerberg, Maria Kasper, Pawel Zajac, Gioele La Manno|год=2014-02|doi=10.1038/nmeth.2772|issn=1548-7105|выпуск=2|язык=en|страницы=163–166|издание=Nature Methods|заглавие=Quantitative single-cell RNA-seq with unique molecular identifiers|ссылка=https://www.nature.com/articles/nmeth.2772|том=11}}</ref>. Дальнейший анализ проводится именно с числом различных уникальных молекулярных идентификаторов гена на клетку, а не покрытием гена.
-{{См. также|Баркодирование ДНК}}
-Полноценное транскриптомное исследование, к примеру, целой ткани с помощью методов scRNA-Seq требует анализа профилей нескольких тысяч, а иногда и миллионов отдельных клеток-представителей ткани. При таких объёмах секвенирование каждой отдельной клетки приводит к большим затратам времени и средств. Для повышения производительности и удешевления исследований к методам scRNA-Seq была адаптирована технология {{Не переведено|:en:Unique molecular identifier|Уникальный молекулярный идентификатор|уникальных молекулярных идентификаторов}} или «молекулярных штрихкодов» — коротких случайных последовательностей, встраиваемых в олиго([[Дезокситимидин|дТ]]) праймер механизма смены матрицы. Это позволяет секвенировать единовременно РНК-материал сотен клеток, при благодаря штрихкодам сохраняется информация о том, из какой конкретно клетки получена данная молекула РНК<ref name="jaitin2014" />. Также молекулярные штрихкоды могут использоваться для подсчёта количества каждого транскрипта в отдельной клетке, это даёт более точные результаты, чем традиционный подсчёт ридов при [[Полимеразная цепная реакция в реальном времени|ПЦР в реальном времени]]<ref>{{Статья|автор=Saiful Islam, Amit Zeisel, Simon Joost, Gioele La Manno, Pawel Zajac|заглавие=Quantitative single-cell RNA-seq with unique molecular identifiers|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24363023|язык=|издание=Nature Methods|тип=|год=2014|месяц=|число=|том=11|выпуск=2|номер=|страницы=163–166|issn=1548-7105|doi=10.1038/nmeth.2772|pmid=24363023}}</ref><ref>{{Статья|автор=Dominic Grun, Lennart Kester, Alexander van Oudenaarden|заглавие=Validation of noise models for single-cell transcriptomics|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24747814|язык=en|издание=Nature Methods|тип=|год=2014|месяц=|число=|том=11|выпуск=6|номер=|страницы=637–640|issn=1548-7105|doi=10.1038/nmeth.2930|pmid=24747814}}</ref><ref>{{Статья|автор=Teemu Kivioja, Anna Vaharautio, Kasper Karlsson, Martin Bonke, Martin Enge|заглавие=Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22101854|язык=en|издание=Nature Methods|тип=|год=2011|месяц=|число=|том=9|выпуск=1|номер=|страницы=72–74|issn=1548-7105|doi=10.1038/nmeth.1778|pmid=22101854}}</ref>.
+== Анализ данных ==
+[[Файл:Различные этапы исследования РНК отдельных клеток, на которых применяются методы биоинформатики.png|мини|300px|'''Различные этапы исследования РНК отдельных клеток, на которых применяются методы биоинформатики<ref name=":3">{{Статья|автор=Duhee Bang, Ji Hyun Lee, Byungjin Hwang|год=2018-08-07|doi=10.1038/s12276-018-0071-8|issn=2092-6413|выпуск=8|язык=en|страницы=96|издание=Experimental & Molecular Medicine|заглавие=Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines|ссылка=https://www.nature.com/articles/s12276-018-0071-8|том=50}}</ref>'''<br>А. Контроль качества результатов эксперимента<br>Б. Примеры исследования гетерогенных популяций клеток: разные клеточные типы, спектр состояний клеток в ткани, спектр состояний клеток при развитии или ином биологическом процессе<br>В. Анализ источников и уровня шума: биологического и технического]]Первоочередной задачей при биоинформатическом анализе результатов секвенирования РНК одиночных клеток является получение [[Матрица (математика)|матрицы]] [[Экспрессия генов|экспрессий генов]] из прочтений секвенатора. После получения такой матрицы несколько направлений анализа<ref name=":3" />:
+# Анализ на клеточном уровне: кластеризация, классификация и определение клеточных траекторий.
+# Анализ на уровне генов: определение дифференциально экспрессирующихся генов, регуляторных сетей.
+=== Получение матрицы экспрессии генов ===
+Стандартный протокол обработки прочтений, получаемых при секвенировании, включает в себя несколько шагов<ref name=":4">{{Статья|автор=Tieliu Shi, Baitang Ning, Geng Chen|год=2019|doi=10.3389/fgene.2019.00317|issn=1664-8021|язык=English|издание=Frontiers in Genetics|заглавие=Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis|ссылка=https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2019.00317/full|том=10}}</ref>:
+# Контроль качества прочтений ([https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ FastQC]).
+# Картирование прочтений на референсный геном ([https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml TopHat2]<ref>{{Статья|автор=Daehwan Kim, Geo Pertea, Cole Trapnell, Harold Pimentel, Ryan Kelley|год=2013-04-25|doi=10.1186/gb-2013-14-4-r36|issn=1474-760X|выпуск=4|страницы=R36|издание=Genome Biology|заглавие=TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions|ссылка=https://doi.org/10.1186/gb-2013-14-4-r36|том=14}}</ref>, [http://www.ccb.jhu.edu/software/hisat/index.shtml HISAT]<ref>{{Статья|автор=Steven L. Salzberg, Ben Langmead, Daehwan Kim|год=2015-04|doi=10.1038/nmeth.3317|issn=1548-7105|выпуск=4|язык=en|страницы=357–360|издание=Nature Methods|заглавие=HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements|ссылка=https://www.nature.com/articles/nmeth.3317|том=12}}</ref> и др.).
+# Подсчёт количества транскриптов исследуемых генов для каждой из клеток (используя характеристики покрытия {{Не переведено|:en:RNA-Seq#Gene_expression|FPKM/TPM|FPKM/TPM}} или число уникальных молекулярных идентификаторов).
+# При необходимости (например, если два набора данных были получены в разных местах и разными людьми) выполнять поправку систематической ошибки ([https://github.com/theislab/kBET kBET]<ref>{{Статья|автор=Fabian J. Theis, Sarah A. Teichmann, F. Alexander Wolf, Zhichao Miao, Maren Büttner|год=2019-01|doi=10.1038/s41592-018-0254-1|issn=1548-7105|выпуск=1|язык=en|страницы=43–49|издание=Nature Methods|заглавие=A test metric for assessing single-cell RNA-seq batch correction|ссылка=https://www.nature.com/articles/s41592-018-0254-1|том=16}}</ref>).
+# В случае, если использовался протокол без уникальных молекулярных идентификаторов, необходима нормализация матрицы ([https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/SCnorm.html SCnorm]<ref>{{Статья|автор=Rhonda Bacher, Li-Fang Chu, Ning Leng, Audrey P Gasch, James A Thomson|год=2017-6|doi=10.1038/nmeth.4263|issn=1548-7091, 1548-7105|выпуск=6|язык=en|страницы=584–586|издание=Nature Methods|заглавие=SCnorm: robust normalization of single-cell RNA-seq data|ссылка=http://www.nature.com/articles/nmeth.4263|том=14}}</ref>, [https://github.com/shka/R-SAMstrt SAMstrt]<ref>{{Статья|автор=Juha Kere, Sten Linnarsson, Virpi Töhönen, Shintaro Katayama|год=2013-11-15|doi=10.1093/bioinformatics/btt511|issn=1367-4803|выпуск=22|язык=en|страницы=2943–2945|издание=Bioinformatics|заглавие=SAMstrt: statistical test for differential expression in single-cell transcriptome with spike-in normalization|ссылка=https://academic.oup.com/bioinformatics/article/29/22/2943/316529|том=29}}</ref>).
+# Восстановление пропущенных данных ({{Не переведено|:en:Imputation_(statistics)|Импутация|импутация}}) ([https://github.com/KrishnaswamyLab/MAGIC MAGIC]<ref>{{Статья|автор=Dana Pe’er, Smita Krishnaswamy, Guy Wolf, Linas Mazutis, Brian Bierie|год=2018-07-26|doi=10.1016/j.cell.2018.05.061|issn=0092-8674, 1097-4172|выпуск=3|язык=English|страницы=716–729.e27|издание=Cell|заглавие=Recovering Gene Interactions from Single-Cell Data Using Data Diffusion|ссылка=https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(18)30724-4|том=174}}</ref>, [https://github.com/divyanshu-talwar/AutoImpute Autoimpute]<ref>{{Статья|автор=Angshul Majumdar, Debarka Sengupta, Aanchal Mongia, Divyanshu Talwar|год=2018-11-05|doi=10.1038/s41598-018-34688-x|issn=2045-2322|выпуск=1|язык=en|страницы=16329|издание=Scientific Reports|заглавие=AutoImpute: Autoencoder based imputation of single-cell RNA-seq data|ссылка=https://www.nature.com/articles/s41598-018-34688-x|том=8}}</ref>).
+[[Файл:Gene expression matrix.jpg|слева|мини|261x261пкс|Нормированная и центрированная матрица генной экспрессии. Строки - это анализируемые гены, столбцы - это анализируемые клетки. Цветом условно изображен уровень экспрессии гена в клетке.]]
+[[Файл:Кластеризация.png|слева|мини|375x375пкс|Иерархическая кластеризация клеток по профилям экспрессии генов]]
+=== Кластеризация ===
+С целью выявления клеточных субпопуляций обычно проводится кластеризация клеток по схожести их [[Количественный анализ экспрессии генов|профилей экспрессии генов]]<ref>{{Статья|автор=Vasilis Ntranos, Govinda M. Kamath, Jesse M. Zhang, Lior Pachter, David N. Tse|год=2016-05-26|doi=10.1186/s13059-016-0970-8|issn=1474-760X|выпуск=1|страницы=112|издание=Genome Biology|заглавие=Fast and accurate single-cell RNA-seq analysis by clustering of transcript-compatibility counts|ссылка=https://doi.org/10.1186/s13059-016-0970-8|том=17}}</ref>. Эта кластеризация может проводиться многими способами: [[Метод k-средних|методом k-средних]]<ref>{{Статья|автор=Aviv Regev, Alexander F. Schier, David Gennert, Jeffrey A. Farrell, Rahul Satija|год=2015-05|doi=10.1038/nbt.3192|issn=1546-1696|выпуск=5|язык=en|страницы=495–502|издание=Nature Biotechnology|заглавие=Spatial reconstruction of single-cell gene expression data|ссылка=https://www.nature.com/articles/nbt.3192|том=33}}</ref>, с использованием [[Граф ближайших соседей|графа ближайших соседей]]<ref>{{Статья|автор=Amos Tanay, Aviezer Lifshitz, Michael Hoichman, Zohar Meir, Elad Chomsky|год=2018-10-08|doi=10.1101/437665|язык=en|страницы=437665|издание=bioRxiv|заглавие=MetaCell: analysis of single cell RNA-seq data using k-NN graph partitions|ссылка=https://www.biorxiv.org/content/10.1101/437665v1}}</ref>, иерархической [[Кластерный анализ|кластеризацией]]<ref>{{Статья|автор=Jesse M. Zhang, Jue Fan, H. Christina Fan, David Rosenfeld, David N. Tse|год=2018-03-09|doi=10.1186/s12859-018-2092-7|issn=1471-2105|выпуск=1|страницы=93|издание=BMC Bioinformatics|заглавие=An interpretable framework for clustering single-cell RNA-Seq datasets|ссылка=https://doi.org/10.1186/s12859-018-2092-7|том=19}}</ref> и некоторыми другими методами. Несмотря на обилие методов кластеризации данных транскриптомики одиночных клеток, она получается сразу не всегда: структура данных может скрываться за техническим шумом и систематическими ошибками<ref>{{Статья|автор=Yoav Gilad, Jonathan K. Pritchard, Jonathan E. Burnett, David A. Knowles, Chiaowen Joyce Hsiao|год=2017-01-03|doi=10.1038/srep39921|issn=2045-2322|язык=en|страницы=39921|издание=Scientific Reports|заглавие=Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies|ссылка=https://www.nature.com/articles/srep39921|том=7}}</ref><ref>{{Статья|автор=Rafael A. Irizarry, Mingxiang Teng, F. William Townes, Stephanie C. Hicks|год=2017-05-08|doi=10.1101/025528|язык=en|страницы=025528|издание=bioRxiv|заглавие=Missing Data and Technical Variability in Single-Cell RNA- Sequencing Experiments|ссылка=https://www.biorxiv.org/content/10.1101/025528v4}}</ref>, также при анализе имеет место [[проклятие размерности]]. Для того, чтобы уменьшить эти эффекты, размерность транскриптомного пространства понижается различными методами.
+[[Файл:T-SNE and PCA.png|мини|306x306пкс|Примеры результатов снижения размерности с использованием метода главных компонент (слева) и алгоритма t-SNE (справа) на одинаковых данных]]
+=== Уменьшение размерности ===
+Каждая клетка в анализируемой матрице экспрессий — это вектор в n-мерном пространстве, где n соответствует числу анализируемых генов, а координаты клетки — это уровни экспрессий соответствующих генов в ней<ref>{{Статья|автор=Luca Pinello, Guo-Cheng Yuan, Jason D. Buenrostro, Andrei Zinovyev, David M. Langenau|год=2019-04-23|doi=10.1038/s41467-019-09670-4|issn=2041-1723|выпуск=1|язык=en|страницы=1903|издание=Nature Communications|заглавие=Single-cell trajectories reconstruction, exploration and mapping of omics data with STREAM|ссылка=https://www.nature.com/articles/s41467-019-09670-4|том=10}}</ref>. Как уже было сказано, снижение размерности может помочь восстановить структуру данных и уменьшить шумы, и потому размерность векторов экспрессий клеток необходимо понизить (при помощи [[Метод главных компонент|метода главных компонент]]<ref>{{Статья|автор=Snehalika Lall, Debajyoti Sinha, Sanghamitra Bandyopadhyay, Debarka Sengupta|год=2018-08-22|doi=10.1089/cmb.2018.0027|выпуск=12|страницы=1365–1373|издание=Journal of Computational Biology|заглавие=Structure-Aware Principal Component Analysis for Single-Cell RNA-seq Data|ссылка=https://www.liebertpub.com/doi/abs/10.1089/cmb.2018.0027|том=25}}</ref>, [[Стохастическое вложение соседей с t-распределением|''t''-SNE]]<ref>{{Статья|автор=Philipp Berens, Dmitry Kobak|год=2018-10-25|doi=10.1101/453449|язык=en|страницы=453449|издание=bioRxiv|заглавие=The art of using t-SNE for single-cell transcriptomics|ссылка=https://www.biorxiv.org/content/10.1101/453449v1}}</ref>, [[Многомерное шкалирование|многомерного шкалирования]]<ref>{{Статья|автор=Serafim Batzoglou, Emma Pierson, Junjie Zhu, Bo Wang|год=2016-05-09|doi=10.1101/052225|язык=en|страницы=052225|издание=bioRxiv|заглавие=Visualization and analysis of single-cell RNA-seq data by kernel-based similarity learning|ссылка=https://www.biorxiv.org/content/10.1101/052225v1}}</ref>, UMAP<ref>{{Статья|автор=Evan W. Newell, Florent Ginhoux, Lai Guan Ng, Immanuel W. H. Kwok, Charles-Antoine Dutertre|год=2019-01|doi=10.1038/nbt.4314|issn=1546-1696|выпуск=1|язык=en|страницы=38–44|издание=Nature Biotechnology|заглавие=Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP|ссылка=https://www.nature.com/articles/nbt.4314|том=37}}</ref> и прочих).
+=== Дифференциальная экспрессия генов ===
+Анализ дифференциальной экспрессии полезен для выявления дифференциально экспрессируемых генов между различными клеточными популяциями. Такие гены являются во многом характеризуют особенности изучаемых клеток и являются их маркерами<ref name=":4" />. Сначала для идентификации дифференциальной экспрессии использовали инструменты, созданные для работы с транскриптомикой популяций клеток (тканей, органов); сейчас же существует ряд программ ([https://github.com/RGLab/MAST MAST]<ref>{{Статья|автор=Greg Finak, Andrew McDavid, Masanao Yajima, Jingyuan Deng, Vivian Gersuk|год=2015-12-10|doi=10.1186/s13059-015-0844-5|issn=1474-760X|выпуск=1|страницы=278|издание=Genome Biology|заглавие=MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data|ссылка=https://doi.org/10.1186/s13059-015-0844-5|том=16}}</ref>, [https://hms-dbmi.github.io/scde/ SCDE]<ref>{{Статья|автор=David T. Scadden, Lev Silberstein, Peter V. Kharchenko|год=2014-07|doi=10.1038/nmeth.2967|issn=1548-7105|выпуск=7|язык=en|страницы=740–742|издание=Nature Methods|заглавие=Bayesian approach to single-cell differential expression analysis|ссылка=https://www.nature.com/articles/nmeth.2967|том=11}}</ref>), создававшихся для поиска дифференциальной экспрессии в данных секвенирования отдельных клеток.
+=== Генные регуляторные сети ===
+{{Не переведено|:en:Gene_regulatory_network|Генная регуляторная сеть|Генная регуляторная сеть}} — это совокупность молекулярных регуляторов, взаимодействующих друг с другом и другими веществами в клетке, регулируя уровни экспрессии<ref>{{Статья|автор=Benjamin Haibe-Kains, Matthias Dehmer, Frank Emmert-Streib|год=2014|doi=10.3389/fcell.2014.00038|issn=2296-634X|язык=English|издание=Frontiers in Cell and Developmental Biology|заглавие=Gene regulatory networks and their applications: understanding biological and medical problems in terms of networks|ссылка=https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2014.00038/full|том=2}}</ref>. Они играют центральную роль в морфогенезе и играют центральную роль в эволюционной биологии развития. Генную регуляторную сеть можно представить, в котором вершины — это гены, а рёбра — это их ко-регуляция. Существуют методы, определяющие регуляторные сети при помощи поиска корреляций между экспрессиями различных генов, однако такой подход не позволяет детектировать нелинейные взаимодействия, поэтому сейчас существует множество методов, основанных на машинном обучении<ref>{{Статья|автор=Susumu Goto, Minoru Kanehisa, Yuki Moriya, Yoshihiro Yamanishi, Masaaki Kotera|год=2012-07-01|doi=10.1093/nar/gks459|issn=0305-1048|выпуск=W1|язык=en|страницы=W162–W167|издание=Nucleic Acids Research|заглавие=GENIES: gene network inference engine based on supervised analysis|ссылка=https://academic.oup.com/nar/article/40/W1/W162/1076097|том=40}}</ref>, вероятностных моделях<ref>{{Статья|автор=Wei Zhang, Seungchan Kim, Edward R. Dougherty, Ilya Shmulevich|год=2002-02-01|doi=10.1093/bioinformatics/18.2.261|issn=1367-4803|выпуск=2|язык=en|страницы=261–274|издание=Bioinformatics|заглавие=Probabilistic Boolean networks: a rule-based uncertainty model for gene regulatory networks|ссылка=https://academic.oup.com/bioinformatics/article/18/2/261/225574|том=18}}</ref>, а также теории информации<ref>{{Статья|автор=Luonan Chen, Zhi-Ping Liu, Jin-Kao Hao, Jingdong Liu, Yongwei Cao|год=2012-01-01|doi=10.1093/bioinformatics/btr626|issn=1367-4803|выпуск=1|язык=en|страницы=98–104|издание=Bioinformatics|заглавие=Inferring gene regulatory networks from gene expression data by path consistency algorithm based on conditional mutual information|ссылка=https://academic.oup.com/bioinformatics/article/28/1/98/221936|том=28}}</ref>.
+=== Поиск траекторий дифференцировок клеток ===
+Клетки постоянно находятся в динамических процессах и реагируют на различные воздействия окружающей среды. Эти процессы сопровождаются и изменением профиля транскрипции клетки. Сама постановка эксперимента по секвенированию РНК одиночных клеток позволяет захватывать клетки в их разные стадии дифференцировки. Если промежуточных стадий отсеквенировано достаточно много, можно отследить путь дифференцировки клетки в транскриптомном пространстве в течение «псевдовремени»<ref>{{Статья|автор=John C. Marioni, Antonio Scialdone, Jonathan A. Griffiths|год=2018-04-01|doi=10.15252/msb.20178046|issn=1744-4292, 1744-4292|выпуск=4|язык=en|страницы=e8046|издание=Molecular Systems Biology|заглавие=Using single‐cell genomics to understand developmental processes and cell fate decisions|ссылка=http://msb.embopress.org/content/14/4/e8046|том=14}}</ref>, сейчас существует множество методов реконструкции таких траекторий<ref>{{Статья|автор=Yvan Saeys, Helena Todorov, Robrecht Cannoodt, Wouter Saelens|год=2019-05|doi=10.1038/s41587-019-0071-9|issn=1546-1696|выпуск=5|язык=en|страницы=547–554|издание=Nature Biotechnology|заглавие=A comparison of single-cell trajectory inference methods|ссылка=https://www.nature.com/articles/s41587-019-0071-9|том=37}}</ref>.
 == Применение ==
@@ Строка 109: / Строка 146: @@
 Отличия между отдельными клетками — фундаментальная характеристика популяций [[Стволовые клетки|стволовых клеток]], но эти отличия размываются при традиционном анализе ансамблей клеток. Одноклеточное секвенирование позволяет выявлять эти отличия и обнаруживать различные фенотипы стволовых клеток даже в пределах «однородной» популяции.
-Так, исследователи выявили значительные различия между долгоживущими и короткоживущими [[Гемоцитобласт|гематопоэтическими стволовыми клетками]] мыши и определили, что основной вклад в эти различия вносят гены, отвечающие за [[клеточный цикл]]<ref>{{Статья|автор=Monika S. Kowalczyk, Itay Tirosh, Dirk Heckl, Tata Nageswara Rao, Atray Dixit|заглавие=Single-cell RNA-seq reveals changes in cell cycle and differentiation programs upon aging of hematopoietic stem cells|ссылка=http://genome.cshlp.org/content/25/12/1860|язык=en|издание=Genome Research|год=2015|том=25|выпуск=12|страницы=1860–1872|doi=10.1101/gr.192237.115}}</ref><ref>{{Статья|автор=Jason C. H. Tsang, Yong Yu, Shannon Burke, Florian Buettner, Cui Wang|заглавие=Single-cell transcriptomic reconstruction reveals cell cycle and multi-lineage differentiation defects in Bcl11a -deficient hematopoietic stem cells|ссылка=http://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-015-0739-5|язык=En|издание=Genome Biology|год=2015|том=16|выпуск=1|страницы=178|doi=10.1186/s13059-015-0739-5}}</ref>. Одноклеточное секвенирование РНК было применено для изучения лёгких мыши<ref>{{Статья|автор=Barbara Treutlein, Doug G. Brownfield, Angela R. Wu, Norma F. Neff, Gary L. Mantalas|заглавие=Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq|ссылка=http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nature13173|издание=Nature|том=509|выпуск=7500|страницы=371–375|doi=10.1038/nature13173}}</ref> и позволило найти ранее неизвестные маркеры, специфичные для различных подтипов клеток. Были также исследованы {{Не переведено|:en:Neural stem cell|Нейронные стволовые клетки|нейронные стволовые клетки}} различных видов и их траектории развития<ref>{{Статья|автор=Jaehoon Shin, Daniel A. Berg, Yunhua Zhu, Joseph Y. Shin, Juan Song|заглавие=Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26299571|издание=Cell Stem Cell|год=2015|том=17|выпуск=3|страницы=360–372|issn=1875-9777|doi=10.1016/j.stem.2015.07.013}}</ref>. В другом исследовании было проведено сравнение смен стадий нейронных стволовых клеток у здоровых мышей и мышей, перенёсших {{Не переведено|:en:Brain ischemia|Ишемия головного мозга|ишемию головного мозга}}<ref>{{Статья|автор=Enric Llorens-Bobadilla, Sheng Zhao, Avni Baser, Gonzalo Saiz-Castro, Klara Zwadlo|заглавие=Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26235341|издание=Cell Stem Cell|год=2015|том=17|выпуск=3|страницы=329–340|issn=1875-9777|doi=10.1016/j.stem.2015.07.002}}</ref>.
+Так, были выявлены значительные различия между долгоживущими и короткоживущими [[Гемоцитобласт|гематопоэтическими стволовыми клетками]] мыши и определено, что основной вклад в эти различия вносят гены, отвечающие за [[клеточный цикл]]<ref>{{Статья|автор=Monika S. Kowalczyk, Itay Tirosh, Dirk Heckl, Tata Nageswara Rao, Atray Dixit|заглавие=Single-cell RNA-seq reveals changes in cell cycle and differentiation programs upon aging of hematopoietic stem cells|ссылка=http://genome.cshlp.org/content/25/12/1860|язык=en|издание=Genome Research|год=2015|том=25|выпуск=12|страницы=1860–1872|doi=10.1101/gr.192237.115}}</ref><ref>{{Статья|автор=Jason C. H. Tsang, Yong Yu, Shannon Burke, Florian Buettner, Cui Wang|заглавие=Single-cell transcriptomic reconstruction reveals cell cycle and multi-lineage differentiation defects in Bcl11a -deficient hematopoietic stem cells|ссылка=http://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-015-0739-5|язык=En|издание=Genome Biology|год=2015|том=16|выпуск=1|страницы=178|doi=10.1186/s13059-015-0739-5}}</ref>. Секвенирование РНК одиночных клеток было применено для изучения лёгких мыши<ref>{{Статья|автор=Barbara Treutlein, Doug G. Brownfield, Angela R. Wu, Norma F. Neff, Gary L. Mantalas|заглавие=Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq|ссылка=http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nature13173|издание=Nature|том=509|выпуск=7500|страницы=371–375|doi=10.1038/nature13173}}</ref> и позволило найти ранее неизвестные маркеры, специфичные для различных подтипов клеток. Были также исследованы {{Не переведено|:en:Neural stem cell|Нейронные стволовые клетки|нейронные стволовые клетки}} различных видов и их траектории развития<ref>{{Статья|автор=Jaehoon Shin, Daniel A. Berg, Yunhua Zhu, Joseph Y. Shin, Juan Song|заглавие=Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26299571|издание=Cell Stem Cell|год=2015|том=17|выпуск=3|страницы=360–372|issn=1875-9777|doi=10.1016/j.stem.2015.07.013}}</ref>. В другом исследовании было проведено сравнение смен стадий нейронных стволовых клеток у здоровых мышей и мышей, перенёсших {{Не переведено|:en:Brain ischemia|Ишемия головного мозга|ишемию головного мозга}}<ref>{{Статья|автор=Enric Llorens-Bobadilla, Sheng Zhao, Avni Baser, Gonzalo Saiz-Castro, Klara Zwadlo|заглавие=Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26235341|издание=Cell Stem Cell|год=2015|том=17|выпуск=3|страницы=329–340|issn=1875-9777|doi=10.1016/j.stem.2015.07.002}}</ref>.
 === Исследования эмбриогенеза ===
-Процесс [[Онтогенез|эмбрионального развития]] можно рассматривать как переход от уровня отдельных клеток к уровню организма. Для изучения ранних стадий эмбрионального развития необходимы методы, способные работать с небольшим количеством доступных клеток. С помощью одноклеточного секвенирования РНК удалось провести общий анализ раннего развития [[Млекопитающие|млекопитающих]]<ref>{{Статья|автор=Qiaolin Deng, Daniel Ramskold, Bjorn Reinius, Rickard Sandberg|заглавие=Single-Cell RNA-Seq Reveals Dynamic, Random Monoallelic Gene Expression in Mammalian Cells|ссылка=http://science.sciencemag.org/content/343/6167/193|язык=en|издание=Science|год=2014|том=343|выпуск=6167|страницы=193–196|doi=10.1126/science.1245316}}</ref><ref>{{Статья|автор=Zhigang Xue, Kevin Huang, Chaochao Cai, Lingbo Cai, Chun-yan Jiang|заглавие=Genetic programs in human and mouse early embryos revealed by single-cell RNA sequencing|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23892778|издание=Nature|год=2013|том=500|выпуск=7464|страницы=593–597|issn=1476-4687|doi=10.1038/nature12364}}</ref><ref>{{Статья|автор=Fuchou Tang, Catalin Barbacioru, Siqin Bao, Caroline Lee, Ellen Nordman|заглавие=Tracing the derivation of embryonic stem cells from the inner cell mass by single-cell RNA-Seq analysis|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20452321|издание=Cell Stem Cell|год=2010|том=6|выпуск=5|страницы=468–478|issn=1875-9777|doi=10.1016/j.stem.2010.03.015}}</ref>. Были получены [[Количественный анализ экспрессии генов|профили экспрессии генов]] для клеток человека и мыши периода предимплантационного развития<ref>{{Статья|автор=Fuchou Tang, Catalin Barbacioru, Ellen Nordman, Siqin Bao, Caroline Lee|заглавие=Deterministic and Stochastic Allele Specific Gene Expression in Single Mouse Blastomeres|ссылка=http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0021208|издание=PLOS ONE|год=2011|том=6|выпуск=6|страницы=e21208|issn=1932-6203|doi=10.1371/journal.pone.0021208}}</ref><ref name="yan2013">{{Статья|автор=Liying Yan, Mingyu Yang, Hongshan Guo, Lu Yang, Jun Wu|заглавие=Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells|ссылка=http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nsmb.2660|издание=Nature Structural & Molecular Biology|год=2013|том=20|выпуск=9|страницы=1131–1139|doi=10.1038/nsmb.2660}}</ref>, а также для первичных половых клеток человека в период перехода от стадии миграции к стадии [[Гонады|гонад]]<ref>{{Статья|автор=Fan Guo, Liying Yan, Hongshan Guo, Lin Li, Boqiang Hu|заглавие=The Transcriptome and DNA Methylome Landscapes of Human Primordial Germ Cells|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26046443|издание=Cell|год=2015|том=161|выпуск=6|страницы=1437–1452|issn=1097-4172|doi=10.1016/j.cell.2015.05.015}}</ref>. На клетках мышиных эмбрионов были изучены изменения экспрессии генов в период {{Не переведено|:en:Maternal to zygotic transition|Материнско-зиготический переход|материнско-зиготического перехода}}<ref>{{Статья|автор=Fernando H. Biase, Xiaoyi Cao, Sheng Zhong|заглавие=Cell fate inclination within 2-cell and 4-cell mouse embryos revealed by single-cell RNA sequencing|ссылка=http://genome.cshlp.org/content/24/11/1787|язык=en|издание=Genome Research|год=2014|том=24|выпуск=11|страницы=1787–1796|doi=10.1101/gr.177725.114}}</ref><ref>{{Статья|автор=Junchao Shi, Qi Chen, Xin Li, Xiudeng Zheng, Ying Zhang|заглавие=Dynamic transcriptional symmetry-breaking in pre-implantation mammalian embryo development revealed by single-cell RNA-seq|ссылка=http://dev.biologists.org/content/142/20/3468|язык=en|издание=Development|год=2015|том=142|выпуск=20|страницы=3468–3477|doi=10.1242/dev.123950}}</ref> (процесс замены зародышем материнских мРНК на свои собственные). Было показано, что в эмбрионе мыши активация зиготического генома происходит на стадии 4 клеток, у человека — между четырёх- и восьмиклеточной стадиями<ref name="yan2013"/>.
+Процесс [[Онтогенез|эмбрионального развития]] можно рассматривать как переход от уровня отдельных клеток к уровню организма. Для изучения ранних стадий эмбрионального развития необходимы методы, способные работать с небольшим количеством доступных клеток. С помощью одноклеточного секвенирования РНК удалось провести общий анализ раннего развития [[Млекопитающие|млекопитающих]]<ref>{{Статья|автор=Qiaolin Deng, Daniel Ramskold, Bjorn Reinius, Rickard Sandberg|заглавие=Single-Cell RNA-Seq Reveals Dynamic, Random Monoallelic Gene Expression in Mammalian Cells|ссылка=http://science.sciencemag.org/content/343/6167/193|язык=en|издание=Science|год=2014|том=343|выпуск=6167|страницы=193–196|doi=10.1126/science.1245316}}</ref><ref>{{Статья|автор=Zhigang Xue, Kevin Huang, Chaochao Cai, Lingbo Cai, Chun-yan Jiang|заглавие=Genetic programs in human and mouse early embryos revealed by single-cell RNA sequencing|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23892778|издание=Nature|год=2013|том=500|выпуск=7464|страницы=593–597|issn=1476-4687|doi=10.1038/nature12364}}</ref><ref>{{Статья|автор=Fuchou Tang, Catalin Barbacioru, Siqin Bao, Caroline Lee, Ellen Nordman|заглавие=Tracing the derivation of embryonic stem cells from the inner cell mass by single-cell RNA-Seq analysis|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20452321|издание=Cell Stem Cell|год=2010|том=6|выпуск=5|страницы=468–478|issn=1875-9777|doi=10.1016/j.stem.2010.03.015}}</ref>. Были получены [[Количественный анализ экспрессии генов|профили экспрессии генов]] для клеток человека и мыши периода предимплантационного развития<ref>{{Статья|автор=Fuchou Tang, Catalin Barbacioru, Ellen Nordman, Siqin Bao, Caroline Lee|заглавие=Deterministic and Stochastic Allele Specific Gene Expression in Single Mouse Blastomeres|ссылка=http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0021208|издание=PLOS ONE|год=2011|том=6|выпуск=6|страницы=e21208|issn=1932-6203|doi=10.1371/journal.pone.0021208}}</ref><ref name="yan2013">{{Статья|автор=Liying Yan, Mingyu Yang, Hongshan Guo, Lu Yang, Jun Wu|заглавие=Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells|ссылка=http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nsmb.2660|издание=Nature Structural & Molecular Biology|год=2013|том=20|выпуск=9|страницы=1131–1139|doi=10.1038/nsmb.2660}}</ref>, а также для первичных половых клеток человека в период перехода от стадии миграции к стадии [[Гонады|гонад]]<ref>{{Статья|автор=Fan Guo, Liying Yan, Hongshan Guo, Lin Li, Boqiang Hu|заглавие=The Transcriptome and DNA Methylome Landscapes of Human Primordial Germ Cells|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26046443|издание=Cell|год=2015|том=161|выпуск=6|страницы=1437–1452|issn=1097-4172|doi=10.1016/j.cell.2015.05.015}}</ref>. На клетках мышиных эмбрионов были изучены изменения экспрессии генов в период {{Не переведено|:en:Maternal to zygotic transition|Материнско-зиготический переход|материнско-зиготического перехода}}<ref>{{Статья|автор=Fernando H. Biase, Xiaoyi Cao, Sheng Zhong|заглавие=Cell fate inclination within 2-cell and 4-cell mouse embryos revealed by single-cell RNA sequencing|ссылка=http://genome.cshlp.org/content/24/11/1787|язык=en|издание=Genome Research|год=2014|том=24|выпуск=11|страницы=1787–1796|doi=10.1101/gr.177725.114}}</ref><ref>{{Статья|автор=Junchao Shi, Qi Chen, Xin Li, Xiudeng Zheng, Ying Zhang|заглавие=Dynamic transcriptional symmetry-breaking in pre-implantation mammalian embryo development revealed by single-cell RNA-seq|ссылка=http://dev.biologists.org/content/142/20/3468|язык=en|издание=Development|год=2015|том=142|выпуск=20|страницы=3468–3477|doi=10.1242/dev.123950}}</ref> (процесс замены зародышем материнских мРНК на свои собственные). Было показано, что в эмбрионе мыши активация зиготического генома происходит на стадии 4 клеток, у человека — между четырёх- и восьмиклеточной стадиями<ref name="yan2013"/>. Для нематоды ''[[Caenorhabditis elegans|c. elegans]]'' был составлен молекулярный атлас её эмбрионального развития с клеточным разрешением<ref>{{Статья|автор=John I. Murray, Robert H. Waterston, Junhyong Kim, Cole Trapnell, Kai Tan|год=2019-03-01|doi=10.1101/565549|язык=en|страницы=565549|издание=bioRxiv|заглавие=A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution|ссылка=https://www.biorxiv.org/content/10.1101/565549v2}}</ref>.
 === Анализ тканей ===

Транскриптомика одиночных клеток: различия между версиями

Версия от 04:53, 7 июня 2019

Содержание

Технология секвенирования РНК отдельных клеток

Выделение отдельных клеток

Сортировка флуоресцентно активированных клеток

Микроманипуляция

Оптический пинцет

Лизис клеток

Получение и амплификация кДНК

Обратная транскрипция с олиго(dT)-праймеров

Механизм смены матрицы SMART-seq^[21]

SUPeR-seq^[22]

Транскрипция in vitro (CEL-seq)^[23]

Амплификация по типу катящегося кольца^[25]

Использование молекулярных штрихкодов

Анализ данных

Получение матрицы экспрессии генов

Кластеризация

Уменьшение размерности

Дифференциальная экспрессия генов

Генные регуляторные сети

Поиск траекторий дифференцировок клеток

Применение

Исследования дифференцировки стволовых клеток

Исследования эмбриогенеза

Анализ тканей

Онкологические исследования

Исследования альтернативного сплайсинга

Иммунология

Примечания

Литература

Дополнительные ссылки

Навигация

Транскриптомика одиночных клеток: различия между версиями

Версия от 04:53, 7 июня 2019

Технология секвенирования РНК отдельных клеток

Выделение отдельных клеток

Сортировка флуоресцентно активированных клеток

Микроманипуляция

Оптический пинцет

Лизис клеток

Получение и амплификация кДНК

Обратная транскрипция с олиго(dT)-праймеров

Механизм смены матрицы SMART-seq[21]

SUPeR-seq[22]

Транскрипция in vitro (CEL-seq)[23]

Амплификация по типу катящегося кольца[25]

Использование молекулярных штрихкодов

Анализ данных

Получение матрицы экспрессии генов

Кластеризация

Уменьшение размерности

Дифференциальная экспрессия генов

Генные регуляторные сети

Поиск траекторий дифференцировок клеток

Применение

Исследования дифференцировки стволовых клеток

Исследования эмбриогенеза

Анализ тканей

Онкологические исследования

Исследования альтернативного сплайсинга

Иммунология

Примечания

Литература

Дополнительные ссылки

Навигация

Поиск

Механизм смены матрицы SMART-seq^[21]

SUPeR-seq^[22]

Транскрипция in vitro (CEL-seq)^[23]

Амплификация по типу катящегося кольца^[25]