FAIRE-Seq: различия между версиями
| [отпатрулированная версия] | [непроверенная версия] |
Эрг (обсуждение | вклад) мНет описания правки |
Naguest (обсуждение | вклад) →Преимущества: Раздел, представляющий собой список, был переписан в соответствии с комментарием при номинировании статьи на добротную |
||
| Строка 33: | Строка 33: | ||
Применение FAIRE-seq совместно с другими методами, например с DNase-seq, дает более надежный и качественный результат<ref name=":02" />. |
Применение FAIRE-seq совместно с другими методами, например с DNase-seq, дает более надежный и качественный результат<ref name=":02" />. |
||
== Преимущества == |
== Преимущества == |
||
Для метода FAIRE не требуется предварительной обработки клеток, так как формальдегид добавляется в питательную среду или напрямую к ткани, быстро приводит к клеточной смерти, что позволяет получить хроматин в состоянии, предшествующем фиксации. При этом разное время фиксации формальдегидом при постоянной концентрации дает одинаковый результат. В отличие от [[Иммунопреципитация|ChIP]]<ref>{{Статья|автор=Thea A. Egelhofer, Aki Minoda, Sarit Klugman, Kyungjoon Lee, Paulina Kolasinska-Zwierz|заглавие=An assessment of histone-modification antibody quality|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3017233/|издание=Nature structural & molecular biology|год=2011-1|том=18|выпуск=1|страницы=91–93|issn=1545-9993|doi=10.1038/nsmb.1972}}</ref>, метод не зависит от надежности и вариабельности антител. Кроме того, FAIRE не требует использования ферментов, таких как [[Дезоксирибонуклеаза I|DNase]] или [[:en:Micrococcal_nuclease|MNase]], которые обычно используются в аналогичных методах для обнаружения областей, свободных от нуклеосом. Отсутствие ферментативной обработки делает этот метод менее вариабельным, более надежным и воспроизводимым. |
|||
* В отличие от [[DNase-seq]], не зависит от используемого фермента, для которого необходимо каждый раз в зависимости от производителя подбирать подходящую концентрацию. |
|||
FAIRE легко адаптируется для использования на образцах тканей, потому что FAIRE не требует одноклеточной суспензии или ядерной изоляции. В этом случае единственным дополнительным шагом является измельчение замороженной ткани в крупный порошок перед фиксацией. |
|||
* В отличие от [[Иммунопреципитация|ChIP]], метод не зависит от свойств антител. |
|||
* Простые реактивы, меньшее количество подготовительных процедур делают метод менее вариабельным, более надежным и воспроизводимым. |
|||
С помощью FAIRE можно детектировать дистальные регуляторные элементы, расположенные далеко от промотеров (например, транскрипционные энхансеры), которые не находятся [[DNase-seq]]<ref name=":02" />. |
|||
== Ограничения == |
== Ограничения == |
||
Версия от 19:24, 4 апреля 2018
FAIRE-Seq (англ. Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements sequencing) — метод молекулярной биологии, используемый для определения регуляторных участков последовательности ДНК[1]. FAIRE-Seq является комбинацией метода выделения регуляторных элементов хроматина (FAIRE) и высокопроизводительного секвенирования.
Описание метода
FAIRE — один из методов картирования областей открытого хроматина, наряду с методом определения участков, гиперчувствительных к ДНКазе I (DNase-seq) и методом иммунопреципитации хроматина (ChIP-seq, ChIP-on-chip). Идея метода была предложена в 2003 г. для фракционирования хроматина Saccharomyces cerevisiae на 2 части: первая — участки, транскрибируемые РНК-полимеразой II, вторая — некодирующие последовательности и участки, транскрибируемые РНК-полимеразами I или III[2]. Разделение осуществляется за счет разной степени сшивания формальдегидом отдельных регионов хроматина. В 2007 г. с помощью данного метода были определены регионы, связанные с регуляторной активностью в хроматине человека; таким образом, метод прошел проверку и получил своё название FAIRE[1]. На сегодняшний день существует несколько вариантов метода, предназначенных для тканей животных и растений. При работе с растениями требуются более жесткие условия и продолжительное время фиксации формальдегидом из-за клеточной стенки, восковой кутикулы листьев и воздушных пространств в губчатом мезофилле[3]. Кроме картирования регуляторных участков, метод позволяет сравнивать активные элементы в разных тканях (как опухолевых, так и здоровых). Эксперименты с использованием FAIRE-seq занимают в среднем около трех дней, не включая анализ и интерпретацию полученных данных[4].
Идея метода
В эукариотических клетках открытый хроматин наблюдается в активных регуляторных областях, поэтому выделение участков, небогатых нуклеосомами, позволило бы картировать регуляторные элементы генома вне зависимости от типа клеток[5]. При добавлении формальдегида к культуре ткани образуются сшивки (англ. cross-links) между белками, белками и нуклеиновыми кислотами, в частности ДНК и гистонами или между гистонами. При последующей экстракции фенол-хлороформом свободная от белков ДНК будет находится в водной фазе, а ковалентно связанные ДНК-белковые комплексы — на границе раздела фаз. Таким образом, участки генома, ассоциированные с регуляторной активностью и свободные от нуклеосом (или с небольшим их количеством), находятся над границей раздела фаз в воде. Они могут быть извлечены оттуда, еще раз очищены от оставшихся белков с помощью фенол-хлороформа и переосаждены для последующего анализа. В качестве контроля используется образец ДНК, полученный из той же культуры ткани с помощью тех же процедур, но без фиксации формальдегидом.
Стадии
- Фиксация клеток формальдегидом.
- Лизис клеток и ультразвуковая фрагментация хроматина на участки длинной в среднем 300—400 пар оснований.
- Очистка лизата от клеточной массы.
- Экстракция ДНК фенол-хлороформом.
- Высаживание участков ДНК, содержащихся в водной фазе при экстракции фенол-хлороформом, с последующей обработкой рибонуклеазой А.
- Анализ фрагментов ДНК.
Далее в зависимости от метода анализа полученных участков ДНК выделяют FAIRE-seq (высокопроизводительное секвенирование фрагментов ДНК, например используя Illumina), FAIRE-chip (гибридизация флуоресцентномеченных фрагметов ДНК с ДНК-микрочипами), FAIRE-qPCR (количественный анализ участков ДНК с помощью ПЦР в реальном времени). Сейчас FAIRE-seq почти полностью вытеснил другие способы детекции экстрагированных фрагментов ДНК.
Анализ данных секвенирования
Для анализа данных секвенирования требуется выравнивать последовательности с референсным геномом, для чего используется, например, Bowtie. Затем производится поиск значимых участков (significant enrichment regions). Для этих целей рекомендуется[4] использование ZINBA. В отличие от FAIRE-chip и FAIRE-qPCR, при использовании FAIRE-seq с достаточной глубиной покрытия генома контрольный образец может отсутствовать,
Применение
С помощью FAIRE-seq решаются следующие задачи:
- Описание активных регуляторных элементов генома
- Идентификация индуцируемых регуляторных участков генома
- Поиск целевых промоторов опухолевых факторов
- Обнаружение и проверка потенциальных участков свободного, не связанного с нуклеосомами, хроматина[6]
- Оценка вариабильности нуклеотидного состава регуляторных участков в различных популяциях
Применение FAIRE-seq совместно с другими методами, например с DNase-seq, дает более надежный и качественный результат[5].
Преимущества
Для метода FAIRE не требуется предварительной обработки клеток, так как формальдегид добавляется в питательную среду или напрямую к ткани, быстро приводит к клеточной смерти, что позволяет получить хроматин в состоянии, предшествующем фиксации. При этом разное время фиксации формальдегидом при постоянной концентрации дает одинаковый результат. В отличие от ChIP[7], метод не зависит от надежности и вариабельности антител. Кроме того, FAIRE не требует использования ферментов, таких как DNase или MNase, которые обычно используются в аналогичных методах для обнаружения областей, свободных от нуклеосом. Отсутствие ферментативной обработки делает этот метод менее вариабельным, более надежным и воспроизводимым.
FAIRE легко адаптируется для использования на образцах тканей, потому что FAIRE не требует одноклеточной суспензии или ядерной изоляции. В этом случае единственным дополнительным шагом является измельчение замороженной ткани в крупный порошок перед фиксацией.
С помощью FAIRE можно детектировать дистальные регуляторные элементы, расположенные далеко от промотеров (например, транскрипционные энхансеры), которые не находятся DNase-seq[5].
Ограничения
- Обнаружение некоторых промотеров активно экспрессируемых генов осуществляется хуже, чем другими методами[4].
- Отношение сигнал/шум ниже, чем у DNase-seq и ChIP-seq[4].
- Несмотря на простоту экспериментальной части, для FAIRE-seq, как и для других методов, связанных с обширным секвенированием, необходимо значительное количество вычислительных ресурсов и памяти. В этом плане FAIRE-chip и FAIRE-qPCR могут быть привлекательнее.
- Эффективность фиксации тканей варьирует в зависимости от её свойств (чистота, проницаемость, плотность клеток, содержание жира), что может затруднять сравнение результатов, полученных для разных тканей.
Доступность данных
Для генома человека данные FAIRE-seq доступны как часть проекта ENCODE в UCSC Genome Browser.
Примечания
- ↑ 1 2 Giresi P. G., Kim J., McDaniell R. M., Iyer V. R., Lieb J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. (англ.) // Genome research. — 2007. — Vol. 17, no. 6. — P. 877—885. — doi:10.1101/gr.5533506. — PMID 17179217.
- ↑ Nagy P. L., Cleary M. L., Brown P. O., Lieb J. D. Genomewide demarcation of RNA polymerase II transcription units revealed by physical fractionation of chromatin. (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2003. — Vol. 100, no. 11. — P. 6364—6369. — doi:10.1073/pnas.1131966100. — PMID 12750471.
- ↑ Omidbakhshfard M. A., Winck F. V., Arvidsson S., Riaño-Pachón D. M., Mueller-Roeber B. A step-by-step protocol for formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements from Arabidopsis thaliana. (англ.) // Journal of integrative plant biology. — 2014. — Vol. 56, no. 6. — P. 527—538. — doi:10.1111/jipb.12151. — PMID 24373132.
- ↑ 1 2 3 4 Simon J. M., Giresi P. G., Davis I. J., Lieb J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. (англ.) // Nature protocols. — 2012. — Vol. 7, no. 2. — P. 256—267. — doi:10.1038/nprot.2011.444. — PMID 22262007.
- ↑ 1 2 3 Song L., Zhang Z., Grasfeder L. L., Boyle A. P., Giresi P. G., Lee B. K., Sheffield N. C., Gräf S., Huss M., Keefe D., Liu Z., London D., McDaniell R. M., Shibata Y., Showers K. A., Simon J. M., Vales T., Wang T., Winter D., Zhang Z., Clarke N. D., Birney E., Iyer V. R., Crawford G. E., Lieb J. D., Furey T. S. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. (англ.) // Genome research. — 2011. — Vol. 21, no. 10. — P. 1757—1767. — doi:10.1101/gr.121541.111. — PMID 21750106.
- ↑ Yang C. C., Buck M. J., Chen M. H., Chen Y. F., Lan H. C., Chen J. J., Cheng C., Liu C. C. Discovering chromatin motifs using FAIRE sequencing and the human diploid genome. (англ.) // BMC genomics. — 2013. — Vol. 14. — P. 310. — doi:10.1186/1471-2164-14-310. — PMID 23656909.
- ↑ Thea A. Egelhofer, Aki Minoda, Sarit Klugman, Kyungjoon Lee, Paulina Kolasinska-Zwierz. An assessment of histone-modification antibody quality // Nature structural & molecular biology. — 2011-1. — Т. 18, вып. 1. — С. 91–93. — ISSN 1545-9993. — doi:10.1038/nsmb.1972.