Вирусные векторы: различия между версиями

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Следующая правка →
Содержимое удалено Содержимое добавлено
ВизуальныйВики-текст
Создано переводом страницы «Viral vector»
(нет различий)

Версия от 11:50, 13 февраля 2019

Вирусные векторы - это инструменты, обычно используемые молекулярными биологами для доставки генетического материала в клетки . Этот процесс может выполняться внутри живого организма ( in vivo ) или в культуре клеток ( in vitro ). Вирусы разработали специализированные молекулярные механизмы для эффективного транспорта своих геномов внутри клеток, которые они заражают. Доставка генов или другого генетического материала вектором называется трансдукцией, а инфицированные клетки описываются как трансдуцированные. Молекулярные биологи впервые использовали этот механизм в 1970-х годах. Пол Берг использовал модифицированный вирус SV40, содержащий ДНК бактериофага λ для заражения клеток почки обезьяны, содержащихся в культуре. [1]

Помимо их использования в исследованиях молекулярной биологии, вирусные векторы используются для генной терапии и разработки вакцин .

Основные свойства вирусного вектора

Вирусные векторы адаптированы к их конкретному применению, но обычно имеют несколько ключевых свойств.

  • Безопасность : хотя вирусные векторы иногда создаются из патогенных вирусов, они модифицируются таким образом, чтобы минимизировать риск обращения с ними. Обычно это включает удаление части вирусного генома, критического для репликации вируса . Такой вирус может эффективно инфицировать клетки, но после того, как инфекция произошла, требуется вспомогательный вирус, чтобы обеспечить недостающие белки для производства новых вирионов .
  • Низкая токсичность : вирусный вектор должен оказывать минимальное влияние на физиологию клетки, которую он заражает.
  • Стабильность : некоторые вирусы генетически нестабильны и могут быстро перестраивать свои геномы. Это наносит ущерб предсказуемости и воспроизводимости работы, проводимой с использованием вирусного вектора, и избегается при их разработке.
  • Специфичность типа клеток . Большинство вирусных векторов спроектировано так, чтобы поражать как можно более широкий спектр типов клеток . Однако иногда наоборот предпочтительнее. Вирусный рецептор может быть модифицирован для нацеливания вируса на определенный тип клеток. Вирусы, модифицированные таким образом, называются псевдотипированными .
  • Идентификация : вирусным векторам часто дают определенные гены, которые помогают идентифицировать, какие клетки приняли вирусные гены. Эти гены называются маркерами . Распространенным маркером является устойчивость к определенному антибиотику. Затем клетки можно легко выделить, так как клетки, которые не поглощают гены вирусного вектора, не обладают устойчивостью к антибиотикам и поэтому не могут расти в культуре с соответствующим антибиотиком.

Приложения

Фундаментальные исследования

Вирусные векторы были первоначально разработаны в качестве альтернативы трансфекции нативной ДНК для экспериментов по молекулярной генетике . По сравнению с традиционными методами, такими как осаждение фосфата кальция, трансдукция может гарантировать, что почти 100% клеток инфицированы без серьезного влияния на жизнеспособность клеток. Кроме того, некоторые вирусы интегрируются в геном клетки, способствуя стабильной экспрессии.

Белки, кодируемые генами, могут быть экспрессированы с использованием вирусных векторов, обычно для изучения функции конкретного белка. Вирусные векторы, особенно ретровирусы, стабильно экспрессирующие маркерные гены, такие как GFP , широко используются для постоянной маркировки клеток для отслеживания их и их потомства, например, в экспериментах с ксенотрансплантацией , когда клетки, инфицированные in vitro , имплантируют животному-хозяину.

Инсерцию гена осуществить дешевле, чем нокаут гена . Но дает менее надежные результаты, поскольку иногда неспецифично и оказывает нецелевое воздействие на другие гены. Векторы животных-хозяев также играют важную роль.

Генная терапия

Генная терапия - это метод коррекции дефектных генов, ответственных за развитие болезни. В будущем генная терапия может обеспечить способ лечения генетических нарушений , таких как тяжелый комбинированный иммунодефицит , муковисцидоз или даже гемофилия А. Поскольку эти заболевания являются результатом мутаций в последовательности ДНК для определенных генов, в испытаниях генной терапии использовались вирусы для доставки немутантных копий этих генов в клетки организма пациента. Там было огромное количество лабораторных успехов с генной терапией. Однако, несколько проблем вирусной генной терапии должны быть преодолены, прежде чем она получит широкое применение. Иммунный ответ на вирусы не только препятствует доставке генов к клеткам-мишеням, но может вызвать серьезные осложнения для пациента. В одном из ранних испытаний генной терапии в 1999 году это привело к смерти Джесси Гелсингера , которого лечили аденовирусным вектором. [2]

Некоторые вирусные векторы, например гамма-ретровирусы, вставляют свои геномы в кажущееся случайным место на одной из хромосом хозяина, что может нарушать функцию клеточных генов и приводить к раку. В 2002 году в исследовании по тяжелой комбинированной иммунодефицитной ретровирусной генной терапии у четырех пациентов развился лейкоз в результате лечения; [3] три пациента выздоровели после химиотерапии. [4] Векторы, основанные на аденоассоциированных вирусах , намного безопаснее в этом отношении, поскольку они всегда интегрируются в одном и том же месте в геноме человека, применяя при различных расстройствах, таких как болезнь Альцгеймера . [5]

Вакцины

Вирусы, экспрессирующие патогенные белки, в настоящее время разрабатываются в качестве вакцин против этих патогенов, основанных на том же обосновании, что и ДНК-вакцины . Т-лимфоциты распознают клетки, инфицированные внутриклеточными паразитами, на основе чужеродных белков, продуцируемых в клетке. Т-клеточный иммунитет имеет решающее значение для защиты от вирусных инфекций и таких заболеваний, как малярия . Вирусная вакцина вызывает экспрессию патогенных белков в клетках-хозяевах подобно вакцине Сабина против полиомиелита и другим ослабленным вакцинам . Однако, поскольку вирусные вакцины содержат лишь небольшую часть генов патогена, они намного безопаснее и спорадическая инфекция патогеном невозможна. Аденовирусы активно разрабатываются в качестве вакцин.

Типы

ретровирусы

Ретровирусы являются одной из основ современных подходов генной терапии. Рекомбинантные ретровирусы, такие как вирус мышиного лейкоза Молони, способны стабильно интегрироваться в геном хозяина. Они содержат обратную транскриптазу для создания ДНК-копии генома РНК и интегразу, которая позволяет интегрироваться в геном хозяина. Они использовались в ряде одобренных FDA клинических испытаний, таких как исследование SCID-X1 . [6]

Ретровирусные векторы могут быть либо компетентными по репликации, либо дефектными по репликации. Векторы с дефектом репликации являются наиболее распространенным выбором в исследованиях, поскольку вирусы имеют кодирующие области для генов, необходимые для дополнительных циклов репликации и упаковки вирионов, замененные другими генами или удаленные. Эти вирусы способны заражать клетки-мишени и доставлять вирусную полезную нагрузку, но затем не могут продолжать типичный литический путь, который приводит к лизису и гибели клеток.

И наоборот, компетентные к репликации вирусные векторы содержат все необходимые гены для синтеза вирионов и продолжают размножаться, как только происходит инфекция. Поскольку вирусный геном для этих векторов намного длиннее, длина интересующего фактического вставленного гена ограничена по сравнению с возможной длиной вставки для дефектных по репликации векторов. В зависимости от вирусного вектора, типичная максимальная длина допустимой ДНК-вставки в дефектном по репликации вирусном векторе обычно составляет около 8–10 кБ. [7] Хотя это ограничивает введение многих геномных последовательностей, большинство последовательностей кДНК все еще могут быть приспособлены.

Основным недостатком использования ретровирусов, таких как ретровирус Молони, является необходимость активного деления клеток для трансдукции . В результате клетки, такие как нейроны , очень устойчивы к инфекции и трансдукции ретровирусами.

Существует опасение, что инсерционный мутагенез из-за интеграции в геном хозяина может привести к раку или лейкемии . Эта проблема оставалась теоретической до тех пор, пока генная терапия для десяти пациентов с SCID-X1 с использованием вируса мышиного лейкоза Малони [8] привела к двум случаям лейкемии, вызванным активацией онкогена LMO2 вследствие близкой интеграции вектора. [9]

Лентивирусов

Упаковка и трансдукция лентивирусным вектором.

Лентивирусы являются подклассом ретровирусов. Иногда их используют в качестве векторов для генной терапии благодаря их способности интегрироваться в геном неделящихся клеток, что является уникальной особенностью лентивирусов, поскольку другие ретровирусы могут инфицировать только делящиеся клетки. Вирусный геном в форме РНК подвергается обратной транскрипции, когда вирус попадает в клетку, чтобы произвести ДНК , которая затем вставляется в геном в случайном положении (недавние находки фактически предполагают, что вставка вирусной ДНК не случайна, а направлена специфические активные гены и связанные с организацией генома [10] ) ферментом вирусной интегразы . Вектор, теперь называемый провирусом , остается в геноме и передается потомству клетки при его делении. Сайт интеграции непредсказуем, что может создать проблему. Провирус может нарушать функцию клеточных генов и приводить к активации онкогенов, способствующих развитию рака , что вызывает опасения относительно возможного применения лентивирусов в генной терапии. Однако исследования показали, что лентивирусные векторы имеют меньшую тенденцию к интеграции в местах, которые могут вызвать рак, чем гамма-ретровирусные векторы. [11] Более конкретно, одно исследование показало, что лентивирусные векторы не вызывают ни увеличения частоты опухолей, ни более раннего появления опухолей у мышей со значительно более высокой частотой опухолей. [12] Кроме того, в клинических исследованиях, в которых использовались лентивирусные векторы для доставки генной терапии для лечения ВИЧ, не наблюдалось увеличения мутагенных или онкологических событий.   [ <span title="citation needed for clinical trial data (January 2015)">цитата нужна</span> ] По соображениям безопасности лентивирусные векторы никогда не несут генов, необходимых для их репликации. Для получения лентивируса несколько плазмид трансфицируют в так называемую упаковочную клеточную линию , обычно HEK 293 . Одна или несколько плазмид, обычно называемых упаковочными плазмидами, кодируют белки вириона , такие как капсид и обратная транскриптаза . Другая плазмида содержит генетический материал, который будет доставлен вектором. Он транскрибируется для получения вирусного генома одноцепочечной РНК и отмечен наличием последовательности ψ (psi). Эта последовательность используется для упаковки генома в вирион.

Аденовирусы

В отличие от лентивирусов, аденовирусная ДНК не интегрируется в геном и не реплицируется во время деления клетки. Это ограничивает их использование в фундаментальных исследованиях, хотя аденовирусные векторы все еще используются в экспериментах in vitro, а также in vivo . [13] Их основное применение в генной терапии и вакцинации . Поскольку люди обычно вступают в контакт с аденовирусами , которые вызывают респираторные, желудочно-кишечные и глазные инфекции, большинство пациентов уже выработали нейтрализующие антитела, которые могут инактивировать вирус до того, как он достигнет клетки-мишени. Чтобы преодолеть эту проблему, ученые в настоящее время исследуют аденовирусы, которые заражают различные виды, к которым у людей нет иммунитета.

Аденоассоциированные вирусы

Аденоассоциированный вирус (AAV) - это небольшой вирус, который заражает людей и некоторые другие виды приматов. В настоящее время известно, что AAV не вызывает заболевание и вызывает очень слабый иммунный ответ. AAV может инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки и может включать свой геном в геном клетки-хозяина. Более того, AAV в основном остается эписомальным (репликация без включения в хромосому); выполняя длинное и устойчивое выражение. [14] Эти особенности делают AAV очень привлекательным кандидатом для создания вирусных векторов для генной терапии. [1] Тем не менее, AAV может принести только до 5 КБ, что значительно меньше по сравнению с первоначальной емкостью AAV. [14]

Кроме того, из-за его потенциального использования в качестве вектора генной терапии исследователи создали измененный AAV, называемый самодополняющим аденоассоциированным вирусом (scAAV). Принимая во внимание, что AAV упаковывает одну цепь ДНК и требует процесса синтеза второй цепи, scAAV упаковывает обе цепи, которые отжигаются вместе, чтобы сформировать двухцепочечную ДНК. Пропуская синтез второй цепи, scAAV обеспечивает быструю экспрессию в клетке. [15] В противном случае, scAAV обладает многими характеристиками своего AAV-аналога.

Гибридные

Гибридные векторы - это векторные вирусы , которые генетически сконструированы так, чтобы иметь свойства более чем одного вектора. Вирусы изменены, чтобы избежать недостатков типичных вирусных векторов, которые могут иметь ограниченную нагрузочную способность, иммуногенность, генотоксичность и не поддерживать долгосрочную адекватную трансгенную экспрессию . Благодаря замене нежелательных элементов желаемыми способностями гибридные векторы в будущем могут превзойти стандартные векторы трансфекции с точки зрения безопасности и терапевтической эффективности. [16]

Проблемы в приложении

Выбор вирусного вектора для доставки генетического материала в клетки связан с некоторыми логистическими проблемами. Существует ограниченное количество вирусных векторов, доступных для терапевтического применения. Любой из этих немногих вирусных векторов может вызвать развитие иммунного ответа организма, если вектор рассматривается как чужеродный захватчик. [17] [18] После использования вирусный вектор не может быть снова эффективно использован у пациента, потому что он будет распознаваться организмом. Если вакцина или генная терапия не пройдут клинические испытания , вирус не сможет снова использоваться у пациента для другой вакцины или генной терапии в будущем. Ранее существовавший иммунитет против вирусного вектора также может присутствовать у пациента, что делает терапию неэффективной для этого пациента. [17] [19] Можно противодействовать существовавшему ранее иммунитету при использовании вирусного вектора для вакцинации путем праймирования невирусной ДНК-вакциной , но этот метод представляет собой еще одну проблему и препятствие в процессе распределения вакцины. [20] Существующий иммунитет также может быть подвергнут сомнению путем увеличения дозы вакцины или изменения пути вакцинации . [21] Некоторые недостатки вирусных векторов (такие как генотоксичность и низкая трансгенная экспрессия) могут быть преодолены с помощью гибридных векторов .

Смотрите также

  • Вирусная трансформация

Рекомендации

  1. ↑ 1 2 Goff, S. (1976). "Construction of hybrid viruses containing SV40 and λ phage DNA segments and their propagation in cultured monkey cells". Cell. 9 (4): 695—705. doi:10.1016/0092-8674(76)90133-1. PMID 189942.
  2. ↑ Beardsley T (February 2000). "A tragic death clouds the future of an innovative treatment method". Scientific American.
  3. ↑ McDowell N (15 January 2003). "New cancer case halts US gene therapy trials". New Scientist.
  4. ↑ "Efficacy of Gene Therapy for X-Linked Severe Combined Immunodeficiency". New England Journal of Medicine. 363 (4): 355—364. 22 July 2010. doi:10.1056/NEJMoa1000164. PMID 20660403.
  5. ↑ Sasmita, Andrew Octavian (2018-10-14). "Current viral-mediated gene transfer research for treatment of Alzheimer's disease". Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (англ.): 1—20. doi:10.1080/02648725.2018.1523521. ISSN 0264-8725. PMID 30317930.
  6. ↑ Cavazzana-Calvo, M. (2000). "Gene Therapy of Human Severe Combined Immunodeficiency (SCID)-X1 Disease". Science. 288 (5466): 669—672. Bibcode:2000Sci...288..669C. doi:10.1126/science.288.5466.669. PMID 10784449.
  7. ↑ Retroviruses. — 1997.
  8. ↑ Hacein-Bey-Abina, S. (2002). "Sustained Correction of X-Linked Severe Combined Immunodeficiency by ex Vivo Gene Therapy". New England Journal of Medicine. 346 (16): 1185—1193. doi:10.1056/NEJMoa012616. PMID 11961146.
  9. ↑ Hacein-Bey-Abina, S. (2003). "LMO2-Associated Clonal T Cell Proliferation in Two Patients after Gene Therapy for SCID-X1". Science. 302 (5644): 415—419. Bibcode:2003Sci...302..415H. doi:10.1126/science.1088547. PMID 14564000.
  10. ↑ Marini, B. (2015). "Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection". Nature. 521 (7551): 227—231. Bibcode:2015Natur.521..227M. doi:10.1038/nature14226. PMID 25731161.
  11. ↑ Cattoglio, C. (2007). "Hot spots of retroviral integration in human CD34+ hematopoietic cells". Blood. 110 (6): 1770—1778. doi:10.1182/blood-2007-01-068759. PMID 17507662.
  12. ↑ Montini, E. (2006). "Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration". Nature Biotechnology. 24 (6): 687—696. doi:10.1038/nbt1216. PMID 16732270.
  13. ↑ Ramos-Kuri, M (2015). "Dominant negative Ras attenuates pathological ventricular remodeling in pressure overload cardiac hypertrophy". Biochim. Biophys. Acta. 1853 (11 Pt A): 2870—84. doi:10.1016/j.bbamcr.2015.08.006. PMID 26260012.
  14. ↑ 1 2 Nussbaum, Robert L. Thompson & Thompson Genetics in Medicine / Robert L Nussbaum, Roderick R McInnes. — 2015.
  15. ↑ McCarty, D M (2001). "Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis". Gene Therapy. 8 (16): 1248—54. doi:10.1038/sj.gt.3301514. PMID 11509958.
  16. ↑ Huang, S (2013). "Development of hybrid viral vectors for gene therapy". Biotechnology Advances. 31 (2): 208—23. doi:10.1016/j.biotechadv.2012.10.001. PMID 23070017.
  17. ↑ 1 2 Nayak, S. (2009). "Progress and prospects: Immune responses to viral vectors". Gene Therapy. 17 (3): 295—304. doi:10.1038/gt.2009.148. PMID 19907498.
  18. ↑ Zhou, H. S. (2004). "Challenges and strategies: The immune responses in gene therapy". Medicinal Research Reviews. 24 (6): 748—761. doi:10.1002/med.20009. PMID 15250039.
  19. ↑ Ошибка: не задан параметр |заглавие = в шаблоне {{публикация}}.
  20. ↑ Yang, Z. -Y. (2003). "Overcoming Immunity to a Viral Vaccine by DNA Priming before Vector Boosting". Journal of Virology. 77 (1): 799—803. doi:10.1128/JVI.77.1.799-803.2003. PMID 12477888.
  21. ↑ Pandey, A. (2012). "Impact of Preexisting Adenovirus Vector Immunity on Immunogenicity and Protection Conferred with an Adenovirus-Based H5N1 Influenza Vaccine". PLoS ONE. 7 (3): e33428. Bibcode:2012PLoSO...733428P. doi:10.1371/journal.pone.0033428. PMID 22432020.{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (не помеченный открытым DOI) (ссылка)

внешняя ссылка

Источник — https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=Вирусные_векторы&oldid=98085792