Методы секвенирования нового поколения

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск

Секвенирование нового поколения — техника определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК для получения формального описания её первичной структуры. Технология методов секвенирования нового поколения (СНП) позволяет «прочитать» единовременно сразу несколько участков генома, что является главным отличием от более ранних методов секвенирования. СНП осуществляется с помощью повторяющихся циклов удлинения цепи, индуцированного полимеразой, или многократного лигирования олигонуклеотидов. В ходе СНП могут генерироваться до сотен мегабаз и гигабаз нуклеотидных последовательностей за один рабочий цикл.

История секвенирования[править | править вики-текст]

Первая концепция секвенирования была предложена Сэнгером в 1977 году[1]. Технология получила название «метод обрыва цепи». В том же году Максам и Гилберт предложили альтернативный метод, получивший название «метод химической деградации». Необходимость в массовом, качественном и быстром секвенировании стимулировала многочисленные модификации и всевозможные улучшения этих методов. В той или иной степени изменениям подверглись практически все составляющие этого процесса. Переломной точкой развития технологии стало появление ПЦР и автоматизация основных этапов «чтения» ДНК, давшие начало методам секвенирования следующего поколения. Платформы для методов нового поколения основываются на распараллеливании процесса «чтения» ДНК, и таким образом за один прогон работы секвенатора можно определить первичные структуры нескольких участков генома. Секвенаторы нового поколения стали значительно дешевле и гораздо эффективнее своих предшественников. На сегодняшний день производительность некоторых секвенаторов измеряется уже сотнями миллиардов пар оснований, что, например, позволяет подобным приборам сканировать индивидуальный геном человека всего за несколько дней.

Основные принципы всех методов[править | править вики-текст]

Все основные принципы работы технологий СНП базируются на секвенировании ДНК-чипов, используя интерактивные циклические ферментативные реакции с дальнейшим сбором полученной информации в виде иллюстраций. Полученные данные используются для восстановления нуклеотидной последовательности или, как для технологии SOLiD, динуклеотидных «цветов». Несмотря на разные методы получения копий (амплификация) участков генома и на техническую разницу дифференциации различных нуклеотидов в прочтённых последовательностях, общая схема работы для всех секвенаторов одна. Первый этап секвенирования — создание библиотеки случайных последовательностей ДНК, которые можно будет сшить с общедоступными адаптерными последовательностями. Второй этап — создание ампликонов с помощью ПЦР, которые будут использованы как образцы. Третий этап — определение первичной структуры всех фрагментов.

Методы[править | править вики-текст]

Сравнение различных методов СНП[2][3]
метод принцип длина одного прочтения, пар оснований стоимость секвенирования 1 млн пар оснований стоимость секвенатора время работы за цикл количество прочтений за цикл преимущества недостатки
454 Life Sciences пиросеквенирование 400 10$ 500 000$ 7 часов 1 000 000 длина прочтённых геномных участков; скорость стоимость; погрешность
Illumina-SOLEXA SBS (sequncing-by-synthesis) 300 0,05—0,15$ 600 000$ 9 дней до 3 000 000 000 эффективность, стоимость скорость
IonTorrent ионный полупроводник 200 1$ 50 000$ 1,5 часа до 5 000 000 стоимость; скорость погрешность
SOLiD секвенирование на основе лигирования 35—50 0,13$ 595 000$ 9 дней 1 300 000 000 стоимость скорость
Helicos HeliScope 2900 2$ 1 час 35 000—75 000 длина прочтённых геномных участков; скорость низкая производительность при желаемой малой погрешности; стоимость

В связи со стремительным развитием методов секвенирования, параметры методов, такие как стоимость секвенаторов и их работы, время и длины прочтённых участков, могут меняться. Актуальная информация доступна в современных источниках.[4][5]

Roche/454 Life Sciences[править | править вики-текст]

Первая эффективно используемая на коммерческой основе платформа СНП. Компания 454 Life Sciences основана в 2000 году Джонатаном Ротбергом (в производство запущена в 2005 году). Данная технология представляет собой последовательный синтез методов эмульсионного ПЦР и пиросеквенирования.

Амплификация ДНК проходит в каплях воды в масляной эмульсии. В каждой капле воды находится одноцепочечная матрица ДНК, связанная с праймером на бусинке. Далее, каждая бусина помещается на чип, представляющий собой оптическое волокно. Туда же помещаются необходимые для секвенирования ферменты: ДНК-полимераза, люцифераза, АТФ-сульфурилаза. В последней сборке реакция секвенирования идет в ячейках объемом 3,4·106 пкл, на стенках которых есть специальное металлическое покрытие, нивелирующее шум.

Illumina/Solexa[править | править вики-текст]

Авторы метода — британские химики Шанкар Баласубраманиан и Дэвид Кленерман. Этот метод[6] секвенирования использует прикреплённые к микросферам единичные молекулы ДНК. В 2006 году была запущена Solexa Genome Analyzer 1G, первая платформа, генерирующая короткие участки генома. После её приобретения компанией Illumina Genome Analyzer использует оптически прозрачные ячейки с 8 индивидуальными поверхностями, где связываются олигонуклеотиды. В отличие от пиросеквенирования удлинение последовательности происходит постепенно, что позволяет за раз с помощью камеры снимать большие ДНК-чипы.

Applied Biosystems/SOLiD[править | править вики-текст]

Платформа SOLiD (Supported Oligonucleotide Ligation and Detection System 2.0), разработанная Applied Biosystems — технология секвенирования коротких чтений, основанная на лигировании. Метод был предложен в лаборатории Георга Черча и опубликован в 2005 году (был заново просеквенирован геном Escherichia coli). По технологии SOLiD при секвенировании фрагменты ДНК лигируются на олигонуклеотидные адаптеры, прикрепленные к шарикам, далее они амплифицируются с помощью эмульсионной ПЦР.

Одномолекулярное секвенирование Helicos Biosciences[править | править вики-текст]

Первый метод секвенирования единичных молекул, разработанный HeliScope (Helicos BioSciences) имеет производительность около 1Gb/день. Принцип работы: после клональной амплификации образца происходит фрагментация ДНК с последующим полиаденилированием на 3'-конце с дальнейшим секвенированием, чередующимся с промыванием образцов нуклеотидами с флуоресцентной меткой.

Одномолекулярное секвенирование в реальном времени Pacific Biosciences[править | править вики-текст]

Метод одномолекулярного секвенирование в реальном времени (англ. Single molecule real time sequencing, SMRT) основан на наблюдении за работой единичной молекулы ДНК-полимеразы. Использование четырех флуоресцентно-меченных нуклеотидов позволяет определить какой нуклеотид присоединяет ДНК-полимераза в данный момент.

Ion Torrent Sequencing[править | править вики-текст]

Метод основан на связи между химической и цифровой информацией, что позволяет быстрее и проще секвенировать большое количество образцов. Эта технология также называется рН-индуцированным секвенированием. Процесс основан на детекции протонов, которые получаются при синтезе цепи ДНК как побочный продукт. Как следствие, рН раствора меняется, что и можно детектировать.

Платформа Ion Torrent отличается от остальных технологий секвенирования тем, что в ней не используются модифицированные нуклеотиды и оптические методы. Метод Ion Torrent позволяет исследовать транскриптомы, малые РНК, проводить ChIP-seq. Более того, с его помощью можно изучать геномы микробных сообществ.

Нанопоровое секвенирование[править | править вики-текст]

Метод основан на измерении тока ионов через единичную нанопору в непроводящей мембране. При прохождении через эту пору нуклеотидов ток падает. Время, на которое изменяется ток ионов, и величина этого падения зависят от того, какой нуклеотид в данный момент находится внутри поры.

Применение секвенирования нового поколения[править | править вики-текст]

Быстрота и дешевизна методов СНП, недоступная ранее, спровоцировала бум в индустрии геномных исследований. Благодаря СНП появилась возможность делать ранее технически недоступные эксперименты[7][8][9].

Геномный анализ[править | править вики-текст]

Стали доступны геномы разных по сложности живых систем от микроорганизмов до человека, включая геном цитогенетически находящихся в норме клеток миелоидной лейкемии. Увеличение длины чтений ускорило сборку целых геномов.

Направленное пересеквенирование геномов[править | править вики-текст]

Секвенирование определенных регионов в геномах используется для выявления полиморфизмов (в частности однонуклеотидых полиморфизмов) и мутаций в генах, задействованных в развитии опухолевых и других заболеваний. Примером одной из таких широкомасштабных работ может служить проект 1000 геномов.

Применение в сочетании с другими методами[править | править вики-текст]

Использование СНП позволило определять места связывания белков с ДНК (ChIP-seq), взаимодействующие участки ДНК (Определение конформации хромосом) и участки открытого хроматина на протяжении всего генома.

Удешевление и распространение СНП позволяет осуществлять проекты ENCODE и modENCODE.

Метагеномика[править | править вики-текст]

СНП широко используется в исследованиях разнообразия микроорганизмов в различных образцах (например, микробные популяции в океане и почве, идентификация новых вирусов в органах, подлежащих трансплантации, описание характерной для ЖКТ микрофлоры и т. д.)

Секвенирование транскриптома[править | править вики-текст]

На основе СНП создан новый подход РНК-секвенирования (RNA-seq)[10] для картирования и подсчёта транскриптов в биологических образцах. У этого метода есть преимущества над используемым ранее методом ДНК-микрочипов. Например, ДНК-чипы зависят от перекрытия геномных последовательностей, в то время как RNA-seq позволяет охарактеризовать транскрипцию без предварительного знания места начала транскрипции.

Картирование ДНК-связывающих белков и анализ хроматина[править | править вики-текст]

Идентификация регуляторных белков, ассоциированных с геномами, было значительно ускорено с помощью введения в лабораторную практику иммунопреципитации хроматина и гибридизации на микрочипах.

Перспективы применения секвенирования в медицине[править | править вики-текст]

В недалеком будущем технологии секвенирования станут более быстрыми и менее дорогими, что позволит использовать их для идентификации мишеней для лекарственной терапии онкологических больных. Уже в 2013 году анализ по технологии секвенирования следующего поколения (en: next-generation sequencing (NGS)) от момента биопсии до завершения NGS занимал менее 100 дней. Столько же времени занимает секвенирование всего генома (whole genome sequencing, WGS) и секвенирование всего транскриптома (whole transcriptome sequencing, WTS)[11].

См. также[править | править вики-текст]

Примечания[править | править вики-текст]

  1. Next-generation DNA sequencing techniques. N Biotechnol. 2009 - PubMed - NCBI. Проверено 1 мая 2013.
  2. Quail MA, Smith M, Coupland P, Otto TD, Harris SR, Connor TR, Bertoni A, Swerdlow HP, Gu Y (1 January 2012). «A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion torrent, pacific biosciences and illumina MiSeq sequencers». BMC Genomics 13 (1): 341. DOI:10.1186/1471-2164-13-341. PMID 22827831.публикация в открытом доступе
  3. Liu L, Li Y, Li S, Hu N, He Y, Pong R, Lin D, Lu L, Law M (1 January 2012). «Comparison of Next-Generation Sequencing Systems». Journal of Biomedicine and Biotechnology (Hindawi Publishing Corporation) 2012: 1–11. DOI:10.1155/2012/251364. PMID 22829749.публикация в открытом доступе
  4. Comparison of Next-Generation Sequencing Systems. Проверено 1 мая 2013. Архивировано из первоисточника 17 мая 2013.
  5. An Error Occurred Setting Your User Cookie. Проверено 1 мая 2013. Архивировано из первоисточника 17 мая 2013.
  6. http://www.illumina.com/Documents/products/Illumina_Sequencing_Introduction.pdf
  7. Next-generation DNA sequencing : Article : Nature Biotechnology. Проверено 1 мая 2013. Архивировано из первоисточника 17 мая 2013.
  8. Minireview: Applications of Next-Generation Sequencing on Studies of Nuclear Receptor Regulation and Function. Проверено 1 мая 2013. Архивировано из первоисточника 17 мая 2013.
  9. Next-generation sequencing: The future of molecular genetics in poultry production and food safety. Проверено 1 мая 2013. Архивировано из первоисточника 17 мая 2013.
  10. Sequencing technologies — the next generation. Проверено 1 мая 2013. Архивировано из первоисточника 17 мая 2013.
  11. Weiss G. J., Liang W. S., Demeure M. J., Kiefer J. A., Hostetter G. et al. (2013) A Pilot Study Using Next-Generation Sequencing in Advanced Cancers: Feasibility and Challenges. PLoS ONE 8(10): e76438. doi:10.1371/journal.pone.0076438

Литература[править | править вики-текст]