Проточная цитометрия

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Схема оборудования для проведения проточной цитометрии.

Проточная цитометрия — метод исследования дисперсных сред в режиме поштучного анализа элементов дисперсной фазы по сигналам светорассеяния и флуоресценции. Название метода связано с основным приложением, а именно, с исследованием одиночных биологических клеток в потоке.

Основа метода заключается в 1) использовании системы гидрофокусировки, которая обеспечивает прохождение клеток в потоке поодиночке; 2) облучении клетки лазерным излучением; 3) регистрации сигналов светорассеяния и флуоресценции от каждой клетки.

Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Образцы[править | править код]

Принцип[править | править код]

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

  • рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°).
  • рассеяние света под углом 90°.
  • интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности (от 2 до 18-20).

Интенсивность рассеяния зависит от морфологии клетки (размер, форма, внутренняя структура), от ориентации клетки в потоке относительно направления падающего излучения, от состояния поляризации падающего излучения.

Интенсивность флуоресценции формируется за счет двух вкладов: специфической флуоресценции и автофлуоресценции. Специфическая флуоресценция связана с излучением молекул флуорохрома, специфически связанных с определенными клеточными компонентами (рецепторы, внутриклеточные белки, ДНК и др.). Автофлуоресценция связана с излучением собственных молекул клетки (белки, нуклеиновые кислоты и т.д.). Интенсивность специфической флуоресценции зависит от количества молекул флуорохрома в клетке, длины волны возбуждающего излучения, сечения поглощения (экстинкции) флуорохрома на этой длине волны, квантового выхода флуорохрома, числовой апертуры оптической системы сбора флуоресценции, спектрального диапазона системы оптической фильтрации и детекции. Интенсивность автофлуоресценции аналогичным образом зависит от оптических свойств собственных молекул клетки. На практике подготовка клеток перед измерением осуществляется таким образом, чтобы вклад специфической флуоресценции на несколько порядков превышал вклад автофлуоресценции.

Флуорохромы[править | править код]

Тандемные красители:

  • Фикоэритрин — Техасский красный (ECD)
  • Фикоэритрин — Cy5 (PC5)
  • Фикоэритрин — Cy7 (PC7)
  • Аллофикоцианин- Cy7 (APC-Cy7)

«Квантовые точки» QD560, QD590 и т. д.

Преимущества[править | править код]

  • короткое время анализа за счет высокой скорости (до 100 000 событий в секунду)
  • анализ большого количества клеток (до 108 клеток в мл)
  • определение субпопуляций клеток
  • измерение параметров редко встречающихся клеток
  • объективное измерение интенсивности флуоресценции

Применение[править | править код]

Иммунология[править | править код]

  • иммунофенотипирование клеток периферической крови
  • определение фагоцитарной активности (захват меченных флюорохромами бактерий или дрожжей)
  • определение внутриклеточных цитокинов (спонтанная продукция и под действием различных специфических или неспецифических активаторов, таких как ФМА + иономицин, ЛПС, ФНО-альфа)
  • определение внутриклеточных белков, например транскрипционных факторов GATA-3, T-bet, FoxP3 для дискриминации CD4 Т-лимфоцитов
  • определение пролиферативной активности (выявление инкорпорированого бромдезоксиуридина)
  • исследование клеточного цикла
  • оценка клеточной цитотоксичности

Онкология[править | править код]

  • количественный анализ внутриклеточных компонентов (ДНК)
  • анализ стадий клеточного цикла
  • выявление анеуплоидного клона
  • определение пролиферативной активности анеуплоидного клона
  • определение специфических маркеров
  • позволяет проводить наблюдение пациентов, входящих в группу риска
  • оценка состояния иммунной системы:
  • оценка клеточного звена иммунитета (определение субпопуляций лимфоцитов)
  • оценка функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток (NK тест, фагоцитарный тест и т. п.)

Цитология[править | править код]

  • определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток
  • оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов
  • определение экспрессии поверхностных антигенов
  • анализ стадий клеточного цикла
  • измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный pH, концентрация свободных ионов Ca2+, потенциал наружной клеточной мембраны)

Гематология[править | править код]

  • анализ субпопуляционного состава клеток периферической крови
  • подсчет ретикулоцитов, анализ тромбоцитов по специфическим маркерам
  • дифференциальная диагностика лимфопролиферативных заболеваний и реактивных лимфоцитозов
  • диагностика лимфопролиферативных заболеваний
  • диагностика острых лейкозов
  • оценка минимальной резидуальной болезни

Фармакология[править | править код]

  • измерение экспрессии маркеров
  • измерение активности внутриклеточных ферментов
  • определений стадий клеточного цикла в рамках изучения механизмов воздействия различных биологически активных веществ на клеточном уровне

Растениеводство / Сельское хозяйство[править | править код]

  • определение плоидности клеток
  • анализ клеточного цикла
  • анализ и сортировка протопластов

Литература[править | править код]

  1. Davey H. Flow cytometry for clinical microbiology. CLI 2004; 2/3:12-5.
  2. Shapiro H.M. «Practical Flow Cytometry», Alan Liss, .N.Y., 1985.