Проточная цитометрия

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск
Схема оборудования для проведения проточной цитометрии.

Проточная цитометрия — метод исследования дисперсных сред в режиме поштучного анализа элементов дисперсной фазы по сигналам светорассеяния и флуоресценции. Название метода связано с основным приложением, а именно, с исследованием одиночных биологических клеток в потоке.

Основа метода заключается в 1) использовании системы гидрофокуссировки, которая обеспечивает прохождение клеток в потоке поодиночке; 2) облучении клетки лазерным излучением; 3) регистрации сигналов светорассеяния и флуоресценции от каждой клетки.

Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Образцы[править | править вики-текст]

Принцип[править | править вики-текст]

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

  • рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток).
  • рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеток).
  • интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности (от 2 до 18-20)- позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.

Флуорохромы[править | править вики-текст]

Тандемные красители:

  • Фикоэритрин — Техасский красный (ECD)
  • Фикоэритрин — Cy5 (PC5)
  • Фикоэритрин — Cy7 (PC7)
  • Аллофикоцианин- Cy7 (APC-Cy7)

«Квантовые точки» QD560, QD590 и т. д.

Преимущества[править | править вики-текст]

  • короткое время анализа за счет высокой скорости (до 100 000 событий в секунду)
  • анализ большого количества клеток (до 108 клеток в мл)
  • определение субпопуляций клеток
  • измерение параметров редко встречающихся клеток
  • объективное измерение интенсивности флуоресценции

Применение[править | править вики-текст]

Иммунология[править | править вики-текст]

  • иммунофенотипирование клеток периферической крови
  • определение фагоцитарной активности (захват меченных флюорохромами бактерий или дрожжей)
  • определение внутриклеточных цитокинов (спонтанная продукция и под действием различных специфических или неспецифических активаторов, таких как ФМА + иономицин, ЛПС, ФНО-альфа)
  • определение внутриклеточных белков, например транскрипционных факторов GATA-3, T-bet, FoxP3 для дискриминации CD4 Т-лимфоцитов
  • определение пролиферативной активности (выявление инкорпорированого бромдезоксиуридина)
  • исследование клеточного цикла
  • оценка клеточной цитотоксичности

Онкология[править | править вики-текст]

  • количественный анализ внутриклеточных компонентов (ДНК)
  • анализ стадий клеточного цикла
  • выявление анеуплоидного клона
  • определение пролиферативной активности анеуплоидного клона
  • определение специфических маркеров
  • позволяет проводить наблюдение пациентов, входящих в группу риска
  • оценка состояния иммунной системы:
  • оценка клеточного звена иммунитета (определение субпопуляций лимфоцитов)
  • оценка функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток (NK тест, фагоцитарный тест и т. п.)

Цитология[править | править вики-текст]

  • определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток
  • оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов
  • определение экспрессии поверхностных антигенов
  • анализ стадий клеточного цикла
  • измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный pH, концентрация свободных ионов Ca2+, потенциал наружной клеточной мембраны)

Гематология[править | править вики-текст]

  • анализ субпопуляционного состава клеток периферической крови
  • подсчет ретикулоцитов, анализ тромбоцитов по специфическим маркерам
  • дифференциальная диагностика лимфопролиферативных заболеваний и реактивных лимфоцитозов
  • диагностика лимфопролиферативных заболеваний
  • диагностика острых лейкозов
  • оценка минимальной резидуальной болезни

Фармакология[править | править вики-текст]

  • измерение экспрессии маркеров
  • измерение активности внутриклеточных ферментов
  • определений стадий клеточного цикла в рамках изучения механизмов воздействия различных биологически активных веществ на клеточном уровне

Растениеводство / Сельское хозяйство[править | править вики-текст]

  • определение плоидности клеток
  • анализ клеточного цикла
  • анализ и сортировка протопластов

Литература[править | править вики-текст]

  1. Davey H. Flow cytometry for clinical microbiology. CLI 2004; 2/3:12-5.
  2. Shapiro H.M. «Practical Flow Cytometry», Alan Liss, .N.Y., 1985.