Вирусные векторы

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Вирусные векторы - это инструменты, обычно используемые молекулярными биологами для доставки генетического материала в клетки . Этот процесс может выполняться внутри живого организма ( in vivo ) или в культуре клеток ( in vitro ). Вирусы разработали специализированные молекулярные механизмы для эффективного транспорта своих геномов внутри клеток, которые они заражают. Доставка генов или другого генетического материала вектором называется трансдукцией, а инфицированные клетки описываются как трансдуцированные. Молекулярные биологи впервые использовали этот механизм в 1970-х годах. Пол Берг использовал модифицированный вирус SV40, содержащий ДНК бактериофага λ для заражения клеток почки обезьяны, содержащихся в культуре. [1]

Помимо их использования в исследованиях молекулярной биологии, вирусные векторы используются для генной терапии и разработки вакцин .

Основные свойства вирусного вектора[править | править код]

Вирусные векторы адаптированы к их конкретному применению, но обычно имеют несколько ключевых свойств.

  • Безопасность : хотя вирусные векторы иногда создаются из патогенных вирусов, они модифицируются таким образом, чтобы минимизировать риск обращения с ними. Обычно это включает удаление части вирусного генома, критического для репликации вируса . Такой вирус может эффективно инфицировать клетки, но после того, как инфекция произошла, требуется вспомогательный вирус, чтобы обеспечить недостающие белки для производства новых вирионов .
  • Низкая токсичность : вирусный вектор должен оказывать минимальное влияние на физиологию клетки, которую он заражает.
  • Стабильность : некоторые вирусы генетически нестабильны и могут быстро перестраивать свои геномы. Это наносит ущерб предсказуемости и воспроизводимости работы, проводимой с использованием вирусного вектора, и избегается при их разработке.
  • Специфичность типа клеток . Большинство вирусных векторов спроектировано так, чтобы поражать как можно более широкий спектр типов клеток . Однако иногда наоборот предпочтительнее. Вирусный рецептор может быть модифицирован для нацеливания вируса на определенный тип клеток. Вирусы, модифицированные таким образом, называются псевдотипированными .
  • Идентификация : вирусным векторам часто дают определенные гены, которые помогают идентифицировать, какие клетки приняли вирусные гены. Эти гены называются маркерами . Распространенным маркером является устойчивость к определенному антибиотику. Затем клетки можно легко выделить, так как клетки, которые не поглощают гены вирусного вектора, не обладают устойчивостью к антибиотикам и поэтому не могут расти в культуре с соответствующим антибиотиком.

Приложения[править | править код]

Фундаментальные исследования[править | править код]

Вирусные векторы были первоначально разработаны в качестве альтернативы трансфекции нативной ДНК для экспериментов по молекулярной генетике . По сравнению с традиционными методами, такими как осаждение фосфата кальция, трансдукция может гарантировать, что почти 100% клеток инфицированы без серьезного влияния на жизнеспособность клеток. Кроме того, некоторые вирусы интегрируются в геном клетки, способствуя стабильной экспрессии.

Белки, кодируемые генами, могут быть экспрессированы с использованием вирусных векторов, обычно для изучения функции конкретного белка. Вирусные векторы, особенно ретровирусы, стабильно экспрессирующие маркерные гены, такие как GFP , широко используются для постоянной маркировки клеток для отслеживания их и их потомства, например, в экспериментах с ксенотрансплантацией , когда клетки, инфицированные in vitro , имплантируют животному-хозяину.

Инсерцию гена осуществить дешевле, чем нокаут гена . Но дает менее надежные результаты, поскольку иногда неспецифично и оказывает нецелевое воздействие на другие гены. Векторы животных-хозяев также играют важную роль.

Генная терапия[править | править код]

Генная терапия - это метод коррекции дефектных генов, ответственных за развитие болезни. В будущем генная терапия может обеспечить способ лечения генетических нарушений , таких как тяжелый комбинированный иммунодефицит , муковисцидоз или даже гемофилия А. Поскольку эти заболевания являются результатом мутаций в последовательности ДНК для определенных генов, в испытаниях генной терапии использовались вирусы для доставки немутантных копий этих генов в клетки организма пациента. Там было огромное количество лабораторных успехов с генной терапией. Однако, несколько проблем вирусной генной терапии должны быть преодолены, прежде чем она получит широкое применение. Иммунный ответ на вирусы не только препятствует доставке генов к клеткам-мишеням, но может вызвать серьезные осложнения для пациента. В одном из ранних испытаний генной терапии в 1999 году это привело к смерти Джесси Гелсингера , которого лечили аденовирусным вектором. [2]

Некоторые вирусные векторы, например гамма-ретровирусы, вставляют свои геномы в кажущееся случайным место на одной из хромосом хозяина, что может нарушать функцию клеточных генов и приводить к раку. В 2002 году в исследовании по тяжелой комбинированной иммунодефицитной ретровирусной генной терапии у четырех пациентов развился лейкоз в результате лечения; [3] три пациента выздоровели после химиотерапии. [4] Векторы, основанные на аденоассоциированных вирусах , намного безопаснее в этом отношении, поскольку они всегда интегрируются в одном и том же месте в геноме человека, применяя при различных расстройствах, таких как болезнь Альцгеймера . [5]

Вакцины[править | править код]

Вирусы, экспрессирующие патогенные белки, в настоящее время разрабатываются в качестве вакцин против этих патогенов, основанных на том же обосновании, что и ДНК-вакцины . Т-лимфоциты распознают клетки, инфицированные внутриклеточными паразитами, на основе чужеродных белков, продуцируемых в клетке. Т-клеточный иммунитет имеет решающее значение для защиты от вирусных инфекций и таких заболеваний, как малярия . Вирусная вакцина вызывает экспрессию патогенных белков в клетках-хозяевах подобно вакцине Сабина против полиомиелита и другим ослабленным вакцинам . Однако, поскольку вирусные вакцины содержат лишь небольшую часть генов патогена, они намного безопаснее и спорадическая инфекция патогеном невозможна. Аденовирусы активно разрабатываются в качестве вакцин.

Типы[править | править код]

ретровирусы[править | править код]

Ретровирусы являются одной из основ современных подходов генной терапии. Рекомбинантные ретровирусы, такие как вирус мышиного лейкоза Молони, способны стабильно интегрироваться в геном хозяина. Они содержат обратную транскриптазу для создания ДНК-копии генома РНК и интегразу, которая позволяет интегрироваться в геном хозяина. Они использовались в ряде одобренных FDA клинических испытаний, таких как исследование SCID-X1 . [6]

Ретровирусные векторы могут быть либо компетентными по репликации, либо дефектными по репликации. Векторы с дефектом репликации являются наиболее распространенным выбором в исследованиях, поскольку вирусы имеют кодирующие области для генов, необходимые для дополнительных циклов репликации и упаковки вирионов, замененные другими генами или удаленные. Эти вирусы способны заражать клетки-мишени и доставлять вирусную полезную нагрузку, но затем не могут продолжать типичный литический путь, который приводит к лизису и гибели клеток.

И наоборот, компетентные к репликации вирусные векторы содержат все необходимые гены для синтеза вирионов и продолжают размножаться, как только происходит инфекция. Поскольку вирусный геном для этих векторов намного длиннее, длина интересующего фактического вставленного гена ограничена по сравнению с возможной длиной вставки для дефектных по репликации векторов. В зависимости от вирусного вектора, типичная максимальная длина допустимой ДНК-вставки в дефектном по репликации вирусном векторе обычно составляет около 8–10 кБ. [7] Хотя это ограничивает введение многих геномных последовательностей, большинство последовательностей кДНК все еще могут быть приспособлены.

Основным недостатком использования ретровирусов, таких как ретровирус Молони, является необходимость активного деления клеток для трансдукции . В результате клетки, такие как нейроны , очень устойчивы к инфекции и трансдукции ретровирусами.

Существует опасение, что инсерционный мутагенез из-за интеграции в геном хозяина может привести к раку или лейкемии . Эта проблема оставалась теоретической до тех пор, пока генная терапия для десяти пациентов с SCID-X1 с использованием вируса мышиного лейкоза Малони [8] привела к двум случаям лейкемии, вызванным активацией онкогена LMO2 вследствие близкой интеграции вектора. [9]

Лентивирусов[править | править код]

Упаковка и трансдукция лентивирусным вектором.

Лентивирусы являются подклассом ретровирусов. Иногда их используют в качестве векторов для генной терапии благодаря их способности интегрироваться в геном неделящихся клеток, что является уникальной особенностью лентивирусов, поскольку другие ретровирусы могут инфицировать только делящиеся клетки. Вирусный геном в форме РНК подвергается обратной транскрипции, когда вирус попадает в клетку, чтобы произвести ДНК , которая затем вставляется в геном в случайном положении (недавние находки фактически предполагают, что вставка вирусной ДНК не случайна, а направлена специфические активные гены и связанные с организацией генома [10] ) ферментом вирусной интегразы . Вектор, теперь называемый провирусом , остается в геноме и передается потомству клетки при его делении. Сайт интеграции непредсказуем, что может создать проблему. Провирус может нарушать функцию клеточных генов и приводить к активации онкогенов, способствующих развитию рака , что вызывает опасения относительно возможного применения лентивирусов в генной терапии. Однако исследования показали, что лентивирусные векторы имеют меньшую тенденцию к интеграции в местах, которые могут вызвать рак, чем гамма-ретровирусные векторы. [11] Более конкретно, одно исследование показало, что лентивирусные векторы не вызывают ни увеличения частоты опухолей, ни более раннего появления опухолей у мышей со значительно более высокой частотой опухолей. [12] Кроме того, в клинических исследованиях, в которых использовались лентивирусные векторы для доставки генной терапии для лечения ВИЧ, не наблюдалось увеличения мутагенных или онкологических событий.   [ <span title="citation needed for clinical trial data (January 2015)">цитата нужна</span> ] По соображениям безопасности лентивирусные векторы никогда не несут генов, необходимых для их репликации. Для получения лентивируса несколько плазмид трансфицируют в так называемую упаковочную клеточную линию , обычно HEK 293 . Одна или несколько плазмид, обычно называемых упаковочными плазмидами, кодируют белки вириона , такие как капсид и обратная транскриптаза . Другая плазмида содержит генетический материал, который будет доставлен вектором. Он транскрибируется для получения вирусного генома одноцепочечной РНК и отмечен наличием последовательности ψ (psi). Эта последовательность используется для упаковки генома в вирион.

Аденовирусы[править | править код]

В отличие от лентивирусов, аденовирусная ДНК не интегрируется в геном и не реплицируется во время деления клетки. Это ограничивает их использование в фундаментальных исследованиях, хотя аденовирусные векторы все еще используются в экспериментах in vitro, а также in vivo . [13] Их основное применение в генной терапии и вакцинации . Поскольку люди обычно вступают в контакт с аденовирусами , которые вызывают респираторные, желудочно-кишечные и глазные инфекции, большинство пациентов уже выработали нейтрализующие антитела, которые могут инактивировать вирус до того, как он достигнет клетки-мишени. Чтобы преодолеть эту проблему, ученые в настоящее время исследуют аденовирусы, которые заражают различные виды, к которым у людей нет иммунитета.

Аденоассоциированные вирусы[править | править код]

Аденоассоциированный вирус (AAV) - это небольшой вирус, который заражает людей и некоторые другие виды приматов. В настоящее время известно, что AAV не вызывает заболевание и вызывает очень слабый иммунный ответ. AAV может инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки и может включать свой геном в геном клетки-хозяина. Более того, AAV в основном остается эписомальным (репликация без включения в хромосому); выполняя длинное и устойчивое выражение. [14] Эти особенности делают AAV очень привлекательным кандидатом для создания вирусных векторов для генной терапии. [1] Тем не менее, AAV может принести только до 5 КБ, что значительно меньше по сравнению с первоначальной емкостью AAV. [14]

Кроме того, из-за его потенциального использования в качестве вектора генной терапии исследователи создали измененный AAV, называемый самодополняющим аденоассоциированным вирусом (scAAV). Принимая во внимание, что AAV упаковывает одну цепь ДНК и требует процесса синтеза второй цепи, scAAV упаковывает обе цепи, которые отжигаются вместе, чтобы сформировать двухцепочечную ДНК. Пропуская синтез второй цепи, scAAV обеспечивает быструю экспрессию в клетке. [15] В противном случае, scAAV обладает многими характеристиками своего AAV-аналога.

Гибридные[править | править код]

Гибридные векторы - это векторные вирусы , которые генетически сконструированы так, чтобы иметь свойства более чем одного вектора. Вирусы изменены, чтобы избежать недостатков типичных вирусных векторов, которые могут иметь ограниченную нагрузочную способность, иммуногенность, генотоксичность и не поддерживать долгосрочную адекватную трансгенную экспрессию . Благодаря замене нежелательных элементов желаемыми способностями гибридные векторы в будущем могут превзойти стандартные векторы трансфекции с точки зрения безопасности и терапевтической эффективности. [16]

Проблемы в приложении[править | править код]

Выбор вирусного вектора для доставки генетического материала в клетки связан с некоторыми логистическими проблемами. Существует ограниченное количество вирусных векторов, доступных для терапевтического применения. Любой из этих немногих вирусных векторов может вызвать развитие иммунного ответа организма, если вектор рассматривается как чужеродный захватчик. [17] [18] После использования вирусный вектор не может быть снова эффективно использован у пациента, потому что он будет распознаваться организмом. Если вакцина или генная терапия не пройдут клинические испытания , вирус не сможет снова использоваться у пациента для другой вакцины или генной терапии в будущем. Ранее существовавший иммунитет против вирусного вектора также может присутствовать у пациента, что делает терапию неэффективной для этого пациента. [17] [19] Можно противодействовать существовавшему ранее иммунитету при использовании вирусного вектора для вакцинации путем праймирования невирусной ДНК-вакциной , но этот метод представляет собой еще одну проблему и препятствие в процессе распределения вакцины. [20] Существующий иммунитет также может быть подвергнут сомнению путем увеличения дозы вакцины или изменения пути вакцинации . [21] Некоторые недостатки вирусных векторов (такие как генотоксичность и низкая трансгенная экспрессия) могут быть преодолены с помощью гибридных векторов .

См. также[править | править код]

  • Вирусная трансформация

Рекомендации[править | править код]

  1. 1 2 S.; Goff. Construction of hybrid viruses containing SV40 and λ phage DNA segments and their propagation in cultured monkey cells (англ.) // Cell : journal. — Cell Press (англ.), 1976. — Vol. 9, no. 4. — P. 695—705. — DOI:10.1016/0092-8674(76)90133-1. — PMID 189942.
  2. Beardsley T. A tragic death clouds the future of an innovative treatment method (англ.) // Scientific American : magazine. — Springer Nature (англ.), 2000. — February. (недоступная ссылка)
  3. McDowell N. New cancer case halts US gene therapy trials (англ.) // New Scientist : magazine. — 2003. — 15 January.
  4. Efficacy of Gene Therapy for X-Linked Severe Combined Immunodeficiency (англ.) // New England Journal of Medicine : journal. — 2010. — 22 July (vol. 363, no. 4). — P. 355—364. — DOI:10.1056/NEJMoa1000164. — PMID 20660403.
  5. Andrew Octavian; Sasmita. Current viral-mediated gene transfer research for treatment of Alzheimer's disease (англ.) // Biotechnology and Genetic Engineering Reviews : journal. — 2018. — 14 October. — P. 1—20. — ISSN 0264-8725. — DOI:10.1080/02648725.2018.1523521. — PMID 30317930.
  6. Cavazzana-Calvo, M. Gene Therapy of Human Severe Combined Immunodeficiency (SCID)-X1 Disease (англ.) // Science : journal. — 2000. — Vol. 288, no. 5466. — P. 669—672. — DOI:10.1126/science.288.5466.669. — Bibcode2000Sci...288..669C. — PMID 10784449.
  7. Retroviruses. — 1997.
  8. Hacein-Bey-Abina, S. Sustained Correction of X-Linked Severe Combined Immunodeficiency by ex Vivo Gene Therapy (англ.) // New England Journal of Medicine : journal. — 2002. — Vol. 346, no. 16. — P. 1185—1193. — DOI:10.1056/NEJMoa012616. — PMID 11961146.
  9. Hacein-Bey-Abina, S. LMO2-Associated Clonal T Cell Proliferation in Two Patients after Gene Therapy for SCID-X1 (англ.) // Science : journal. — 2003. — Vol. 302, no. 5644. — P. 415—419. — DOI:10.1126/science.1088547. — Bibcode2003Sci...302..415H. — PMID 14564000.
  10. Marini, B. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection (англ.) // Nature : journal. — 2015. — Vol. 521, no. 7551. — P. 227—231. — DOI:10.1038/nature14226. — Bibcode2015Natur.521..227M. — PMID 25731161.
  11. Cattoglio, C. Hot spots of retroviral integration in human CD34+ hematopoietic cells (англ.) // Blood (англ.) : journal. — American Society of Hematology (англ.), 2007. — Vol. 110, no. 6. — P. 1770—1778. — DOI:10.1182/blood-2007-01-068759. — PMID 17507662.
  12. Montini, E. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration (англ.) // Nature Biotechnology : journal. — Nature Publishing Group, 2006. — Vol. 24, no. 6. — P. 687—696. — DOI:10.1038/nbt1216. — PMID 16732270.
  13. M; Ramos-Kuri. Dominant negative Ras attenuates pathological ventricular remodeling in pressure overload cardiac hypertrophy (англ.) // Biochim. Biophys. Acta (англ.) : journal. — 2015. — Vol. 1853, no. 11 Pt A. — P. 2870—2884. — DOI:10.1016/j.bbamcr.2015.08.006. — PMID 26260012.
  14. 1 2 Nussbaum, Robert L. Thompson & Thompson Genetics in Medicine / Robert L Nussbaum, Roderick R McInnes. — 2015.
  15. McCarty, D. M. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis (англ.) // Gene Therapy : journal. — 2001. — Vol. 8, no. 16. — P. 1248—1254. — DOI:10.1038/sj.gt.3301514. — PMID 11509958.
  16. S; Huang. Development of hybrid viral vectors for gene therapy. (англ.) // Biotechnology Advances (англ.) : journal. — 2013. — Vol. 31, no. 2. — P. 208—223. — DOI:10.1016/j.biotechadv.2012.10.001. — PMID 23070017.
  17. 1 2 S.; Nayak. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors (англ.) // Gene Therapy : journal. — 2009. — Vol. 17, no. 3. — P. 295—304. — DOI:10.1038/gt.2009.148. — PMID 19907498.
  18. Zhou, H. S. Challenges and strategies: The immune responses in gene therapy (англ.) // Medicinal Research Reviews : journal. — 2004. — Vol. 24, no. 6. — P. 748—761. — DOI:10.1002/med.20009. — PMID 15250039.
  19. Ошибка: не задан параметр |заглавие= в шаблоне {{публикация}}.
  20. Yang, Z. -Y. Overcoming Immunity to a Viral Vaccine by DNA Priming before Vector Boosting (англ.) // Journal of Virology (англ.) : journal. — 2003. — Vol. 77, no. 1. — P. 799—803. — DOI:10.1128/JVI.77.1.799-803.2003. — PMID 12477888.
  21. A.; Pandey. Impact of Preexisting Adenovirus Vector Immunity on Immunogenicity and Protection Conferred with an Adenovirus-Based H5N1 Influenza Vaccine (англ.) // PLoS ONE (англ.) : journal. — 2012. — Vol. 7, no. 3. — P. e33428. — DOI:10.1371/journal.pone.0033428. — Bibcode2012PLoSO...733428P. — PMID 22432020.

Внешние ссылки[править | править код]