Эта статья выставлена на рецензию

Транскриптомика одиночных клеток: различия между версиями

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Интерактивная навигация по истории
[непроверенная версия][непроверенная версия]
← Предыдущая правкаСледующая правка →
Содержимое удалено Содержимое добавлено
ВизуальныйВики-текст
Строка 5: Строка 5:


== Технология секвенирования РНК отдельных клеток ==
== Технология секвенирования РНК отдельных клеток ==
[[Файл:Scrna seq pipeline.png|мини|480пкс|Схема эксперимента секвенирования РНК одиночных клеток]]
[[Файл:Scrna seq pipeline.png|мини|600пкс|Схема эксперимента секвенирования РНК одиночных клеток]]
Общий алгоритм секвенирования РНК одиночных клеток включает в себя 8 последовательных этапов<ref>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., & Lönnberg, T. (2017). A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine, 9(1). doi:10.1186/s13073-017-0467-4 (https://doi.org/10.1186/s13073-017-0467-4)</ref>:
Общий алгоритм секвенирования РНК одиночных клеток включает в себя 8 последовательных этапов<ref name=“10.1186_s13073-017-0467-4” />:
# Выделение единичных клеток.
# Выделение единичных клеток.
# [[Лизис|Лизис]] единичных клеток.
# [[Лизис|Лизис]] единичных клеток.
# Выделение интересующей нас фракции РНК.
# Выделение интересующей нас фракции РНК с помощью специальных [[Праймер|праймеров]].
# Синтез [[Комплементарная ДНК|кДНК]] с помощью [[Обратная транскрипция|обратной транскрипции]].
# Синтез [[Комплементарная ДНК|кДНК]] с помощью [[Обратная транскрипция|обратной транскрипции]].
# [[Амплификация (молекулярная биология)|Амплификация]] кДНК.
# [[Амплификация (молекулярная биология)|Амплификация]] кДНК.
# Подготовка [[Геномная библиотека|библиотеки]] кДНК.
# Подготовка [[Геномная библиотека|библиотеки]] кДНК.
# Секвенирование.
# [[Методы секвенирования нового поколения|Секвенирование]].
# [[Биоинформатика|Биоинформатическая]] обработка полученных прочтений и анализ данных.
# [[Биоинформатика|Биоинформатическая]] обработка полученных прочтений и анализ данных.

Различные методы подготовки библиотек для секвенирования РНК одиночных клеток отличаются по своей специфичности, точности, стоимости и другим параметрам. Например, Smart-seq2 отличается высокой чувствительностью, а Drop-seq и другие микрофлюидные технологии с использованием микрочастиц высокопроизводительны<ref name="10.1016_j.molcel.2017.01.023">{{Статья|автор=Christoph Ziegenhain, Beate Vieth, Swati Parekh, Björn Reinius, Amy Guillaumet-Adkins, Martha Smets, Heinrich Leonhardt, Holger Heyn, Ines Hellmann, Wolfgang Enard|год=2017|doi=10.1016/j.molcel.2017.01.023|ISSN=1097-2765|выпуск=4|язык=ru|страницы=631-643.e4|издание=Molecular Cell|заглавие=Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods|ссылка=http://dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2017.01.023|том=65}}</ref><ref name="10.1016_j.molcel.2018.10.020" />.
[[Файл:Методы_разделения_одиночных_клеток_для_single-cell_секвенирования.png|480px|Методы разделения одиночных клеток для single-cell RNA-seq.|left]]
=== Выделение отдельных клеток ===
=== Выделение отдельных клеток ===
Перед разделением клеток нужно прервать [[Межклеточные контакты|контакты]] между ними и избавиться от межклеточного вещества. Это может быть достигнуто с помощью [[Фермент|ферментирования]] образца ткани, а также путем специфических манипуляций, таких как, например, [[Лазерная захватывающая микродиссекция|лазерная захватывающая микродиссекция]] <ref>Hedlund, E., Deng, Q., Single-cell RNA sequencing: Technical advancements and biological applications, Molecular Aspects of Medicine (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.mam.2017.07.003</ref>, которая позволяет выделять клетки из образца твердой ткани с помощью лазера. После получения клеточной суспензии клетки разделяют с помощью различных методов<ref>Hwang, B., Lee, J. H., & Bang, D. (2018). Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine, 50(8). doi:10.1038/s12276-018-0071-8 (https://doi.org/10.1038/s12276-018-0071-8)</ref>.
Перед разделением клеток нужно прервать [[Межклеточные контакты|контакты]] между ними и избавиться от межклеточного вещества. Это может быть достигнуто с помощью [[Фермент|ферментирования]] образца ткани, а также путем специфических манипуляций, таких как, например, [[Лазерная захватывающая микродиссекция|лазерная захватывающая микродиссекция]] <ref name="10.1016_j.mam.2017.07.003" />, которая позволяет выделять клетки из образца твердой ткани с помощью лазера. После получения клеточной суспензии клетки разделяют с помощью различных методов<ref name="10.1038_s12276-018-0071-8" />.
* <b>Метод предельного разбавления</b> (англ. limiting dilution). Этот метод заключается в том, что из разбавленной клеточной суспензии пипеткой выделяются отдельные клетки. Процедура производится вручную.
* <b>Метод предельного разбавления</b> (англ. limiting dilution). Этот метод заключается в том, что из разбавленной клеточной суспензии пипеткой выделяются отдельные клетки. Процедура производится вручную.
* <b>Микроманипуляция</b> (англ. micromanipulation). Это метод ручного выделения клеток из ткани под под микроскопом. Он обычно используется для выделения клеток ранних эмбрионов или отбора клеток некультивируемых микроорганизмов.
* <b>Микроманипуляция</b> (англ. micromanipulation). Это метод ручного выделения клеток из ткани под под микроскопом. Он обычно используется для выделения клеток ранних эмбрионов или отбора клеток некультивируемых микроорганизмов.
[[File:Методы разделения одиночных клеток для single-cell секвенирования.png|thumb|Методы разделения одиночных клеток для single-cell секвенирования.]]

* <b>{{Не переведено|Сортировка флуоресцентно активированных клеток|Сортировка флуоресцентно активированных клеток|en|Fluorescence-activated cell sorting (FACS)}}</b> (англ. fluorescence-activated cell sorting (FACS)). Это часто используемый высокопроизводительный метод. Перед сортировкой клетки метят с помощью [[Моноклональные антитела|моноклональных антител]] к поверхностным маркерам, антитела снабжены [[Флуоресценция в биологических исследованиях#Флуоресцентные метки|флуоресцентными метками]].<br> Механическая сортировка происходит следующим образом. Суспензию клеток помещают в прибор, который выбрасывает капли, содержащие по одной клетке, через наконечник специального “распылителя”. Эти капли проходят через луч лазера, и, в зависимости от типа флуоресцентной метки (или их совокупности) на клетке, капля получает заряд, который заставляет ее притягиваться к одной из отклоняющих пластин, в результате чего она попадает в конкретный собирающий сосуд. Возможно также производить негативный отбор - выделять клетки не несущие маркеров.<br>Данный метод не позволяет работать с образцами малого объема (требуется подавать на вход около 10000 клеток) и требует наличия антител к поверхностным белкам.
* <b>{{Не переведено|Сортировка флуоресцентно активированных клеток|сортировка флуоресцентно активированных клеток|en|Fluorescence-activated cell sorting (FACS)}}</b> (англ. fluorescence-activated cell sorting (FACS)). Это часто используемый высокопроизводительный метод. Перед сортировкой клетки метят с помощью [[Моноклональные антитела|моноклональных антител]] к поверхностным маркерам, антитела снабжены [[Флуоресценция в биологических исследованиях#Флуоресцентные метки|флуоресцентными метками]].<br> Механическая сортировка происходит следующим образом. Суспензию клеток помещают в прибор, который выбрасывает капли, содержащие по одной клетке, через наконечник специального “распылителя”. Эти капли проходят через луч лазера, и, в зависимости от типа флуоресцентной метки (или их совокупности) на клетке, капля получает заряд, который заставляет ее притягиваться к одной из отклоняющих пластин, в результате чего она попадает в конкретный собирающий сосуд. Возможно также производить негативный отбор - выделять клетки не несущие маркеров.<br>Данный метод не позволяет работать с образцами малого объема (требуется подавать на вход около 10000 клеток) и требует наличия антител к поверхностным белкам.
* <b>[[Микрогидродинамика|Микрюфлюидные]] технологии</b> (англ. microfluidic technology). Это также высокопроизводительный метод, использующийся наряду с FACS. Он основан на изоляции клеток в микрокаплях буфера, погруженных в гидрофобную среду (масло). Разделение происходит в трубках, диаметр которых подобран так, чтобы капли, содержащие клетки не сливались друг с другом. Капля раствора в которую помещается таким образом клетка содержит реакционную смесь для лизиса, выделения РНК и синтеза кДНК. Такой принцип используется в коммерческом аппарате Fluidigm C1 и позволяет обрабатывать до 1000 клеток параллельно.
* <b>[[Микрогидродинамика|Микрюфлюидные]] технологии</b><ref name="10.1039_c8an01186a">{{Статья|автор=Dan Gao, Feng Jin, Min Zhou, Yuyang Jiang|год=2018|doi=10.1039/c8an01186a|ISSN=0003-2654,1364-5528|выпуск=3|язык=ru|страницы=766-781|издание=The Analyst|заглавие=Recent advances in single cell manipulation and biochemical analysis on microfluidics|ссылка=http://dx.doi.org/10.1039/c8an01186a|том=144}}</ref> (англ. microfluidic technology). Это также высокопроизводительный метод, использующийся наряду с FACS. Он основан на изоляции клеток в микрокаплях буфера, погруженных в гидрофобную среду (масло). Разделение происходит в трубках, диаметр которых подобран так, чтобы капли, содержащие клетки не сливались друг с другом. Капля раствора в которую помещается таким образом клетка содержит реакционную смесь для лизиса, выделения РНК и синтеза кДНК. Такой принцип используется в коммерческом аппарате Fluidigm C1 и позволяет обрабатывать до 1000 клеток параллельно.
* <b>Микрофлюидные технологии с использованием микрочастиц</b> (англ. microdroplet-based microfluidics). Другой похожий принцип также основан на изоляции клеток в гидрофильных микрочастицах жидкости в гидрофобной среде, но помимо клеток в каплю попадает также твердая микрочастица с иммобилизированными на ней праймерами. Так же как и в предыдущем случае в каплях содержатся изолированные клетки, лизирующий буфер и реакционная смесь для обратной транскрипции, в том числе изолированные на микрочастицах праймеры. Этот метод используется в коммерческом аппарате Chromium system from 10× Genomics. Он позволяет работать с каплями меньшего объема, чем микрофлюидные технологии без микрочастиц, и обрабатывать от 1000 до 1000000 клеток.
* <b>Микрофлюидные технологии с использованием микрочастиц</b> (англ. microdroplet-based microfluidics). Другой похожий принцип также основан на изоляции клеток в гидрофильных микрочастицах жидкости в гидрофобной среде, но помимо клеток в каплю попадает также твердая микрочастица с иммобилизированными на ней праймерами. Так же как и в предыдущем случае в каплях содержатся изолированные клетки, лизирующий буфер и реакционная смесь для обратной транскрипции, в том числе изолированные на микрочастицах праймеры. Этот метод используется в коммерческом аппарате Chromium system from 10× Genomics. Он позволяет работать с каплями меньшего объема, чем микрофлюидные технологии без микрочастиц, и обрабатывать от 1000 до 1000000 клеток.
* <b>Микрофлюидные технологии с использованием микроячеек</b>. Данный метод основан на распределении клеток по ячейкам такого размера, который допускает попадание в них не более одной клетки и микрочастицы с иммобилизованными праймерами<ref name="10.1039_c8an01186a" />.
* <b>Выделение редких клеток</b>. Некоторые специфические задачи требуют выделения из популяции очень малочисленных клеток. Например, выделение из крови циркулирующих опухолевых клеток (англ. circulating tumor cells, CTCs) производится с помощью добавления к образцу крови антител с магнитными частицами и выделения меченых клеток с помощью магнита. Для опухолевых клеток эпителиального происхождения используются антитела к CD45− и EpCAM+.
* Некоторые специфические задачи требуют выделения из популяции очень малочисленных клеток. Например, выделение из крови циркулирующих опухолевых клеток (англ. circulating tumor cells, CTCs) производится с помощью добавления к образцу крови антител с магнитными частицами и выделения меченых клеток с помощью магнита. Для опухолевых клеток эпителиального происхождения используются антитела к CD45− и EpCAM+.

⚫
=== Лизис клеток===
⚫
Клетки обычно лизируют химически, помещая их в {{Не переведено|Лизирующий буфер|лизирующий буфер|en|Lysis buffer}}. Лизирующие буферы могут различаться по качеству сохранения содержимого клетки и эффективности дальнейших процедур, проводимых с лизатом<ref>doi=10.3389/fonc.2013.00274</ref>. Оптимальные протоколы лизиса одиночных клеток [[Эукариоты|эукариот]] и [[Прокариоты|прокариот]] также различны, так как требуется разрушить массивную и часто покрытую защитными оболочками клеточную стенку прокариот, и не повредить выделяемый материал<ref>https://doi.org/10.1016/j.bpj.2018.06.008></ref>.
⚫
[[Файл:Схема методов амплификации РНК, применяемых в одноклеточном секвенировании.png|мини|365x365пкс|Схема методов подготовки библиотек кДНК, применяемых в секвенировании РНК одиночных клеток|альт=|слева]]

=== Получение и амплификация кДНК ===
После выделения РНК необходимо получить из нее [[Комплементарная ДНК|комплементарную ДНК]] (кДНК) с помощью [[Обратная транскрипция|обратной транскрипции]]. Первая цепь кДНК синтезируется при помощи специально спроектированной версии [[Обратная транскриптаза|обратной транскриптазы]] вируса лейкемии мышей M-MuLV. При синтезе первой цепи важно избавиться от мало интересующих нас [[Рибосомные рибонуклеиновые кислоты|рРНК]] и [[Транспортные рибонуклеиновые кислоты|тРНК]], которые составляют до 95 % выделенной тотальной РНК клетки<ref>http://dx.doi.org/10.1016/j.mam.2017.07.003</ref>. Для этого применяются различные протоколы. [[Полиаденилирование|Полиаденилированную]] фракцию можно отделить, используя [[Праймер|праймеры]] с поли(dT)-участком. В некоторых методах секвенирования, таких как, например, InDrop и Drop-seq, используются праймеры, пришитые к специальным микросферам<ref>https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.10.020</ref>. Помимо поли(dT)-участка в последовательности таких праймеров зашифрован [[Баркодирование ДНК|баркод]] - уникальная последовательность, которая будет присутствовать во всех молекулах кДНК, полученных из конкретной клетки<ref>DOI:10.1038/s12276-018-0071-8</ref>.

==== Обратная транскрипция с олиго(dT)-праймеров ====
В простейшем случае cначала проводится отбор полиаденилированных РНК и синтез первой цепи кДНК с помощью поли(dT)-праймера (часто с адаптерной последовательностью). Непрореагировавшие праймеры и dNTP удаляют с помощью смеси [[экзонуклеазы]] и [[Щелочная фосфатаза|щелочной фосфатазы]]. Затем с помощью [[ДНК-полимераза#Семейство X|концевой дезоксинуклеотидил-трансферазы]] в среде, содержащей только один тип dNTP (dA), на 3'-конец синтезированной первой цепи кДНК навешивается дополнительный поли(А)-хвост примерно в 30 нуклеотидов. С помощью поли(dT) с другой праймерной последовательностью синтезируется вторая цепь и полученная двуцепочечная кДНК амплифицируется путем ПЦР<ref>{{Статья|автор=M G Thomas, S A Hesse, A T McKie, F Farzaneh|год=1993-08-11|issn=0305-1048|выпуск=16|страницы=3915–3916|издание=Nucleic Acids Research|заглавие=Sequencing of cDNA using anchored oligo dT primers.|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC309939/|том=21}}</ref>.

У этого подхода есть два основных недостатка. Из-за склонности ревертазы к раннему прерыванию 5’-конец имеет значительно меньшее покрытие. Кроме того, после добавления поли(А)-хвоста к 3’-концу кДНК вдобавок к обычному поли(А)-хвосту на 3’ конце РНК (то есть на 5' конце соответствующей кДНК) становится невозможно понять, с какой цепи ДНК эта РНК была изначально транскрибирована<ref>{{Статья|автор=San Ming Wang, Janet D. Rowley, Jianjun Chen, Terry Clark, Clarence Wang|год=2002-04-30|doi=10.1073/pnas.092140899|issn=0027-8424, 1091-6490|выпуск=9|язык=en|страницы=6152–6156|издание=Proceedings of the National Academy of Sciences|заглавие=Oligo(dT) primer generates a high frequency of truncated cDNAs through internal poly(A) priming during reverse transcription|ссылка=https://www.pnas.org/content/99/9/6152|том=99}}</ref>.

==== Механизм смены матрицы SMART-seq<ref>{{Статья|автор=Daniel Ramsköld, Shujun Luo, Yu-Chieh Wang, Robin Li, Qiaolin Deng|год=2012-8|doi=10.1038/nbt.2282|issn=1087-0156|выпуск=8|страницы=777–782|издание=Nature biotechnology|заглавие=Full-Length mRNA-Seq from single cell levels of RNA and individual circulating tumor cells|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3467340/|том=30}}</ref> ====
Чтобы получить однородное покрытие транскриптов был придуман механизм смены матрицы SMART-seq. Этот метод использует свойство ревертазы M-MuLV добавлять 3-4 [[цитозин]]а на 3’-конце кДНК.

После синтеза первой цепи кДНК на матрице РНК добавляют универсальный ПЦР-праймер для смены матрицы с поли(G) и праймерной последовательностью. Он отжигается только на полноразмерные кДНК с цитозинами на конце, на 3’-конце которых благодаря этому достраивается праймерная последовательность. Затем проводят деградацию РНК, синтез второй цепи кДНК с праймером к затравочной последовательности и ПЦР-амплификацию. В результате амплифицируются только целые транскрипты, и информация об исходной цепи не теряется за счёт добавленных цитозинов. Однако этот метод обладает меньшей чувствительностью, чем добавление гомополимерного хвоста.
[[Файл:Super-seq.png|мини|508x508пкс|Схема эксперимента SUPeR-seq]]


⚫
=== Лизис клеток и выделение РНК===
==== SUPeR-seq<ref>{{Статья|автор=Xiaoying Fan, Xiannian Zhang, Xinglong Wu, Hongshan Guo, Yuqiong Hu|год=2015-07-23|doi=10.1186/s13059-015-0706-1|issn=1465-6906|выпуск=1|страницы=148|издание=Genome Biology|заглавие=Single-cell RNA-seq transcriptome analysis of linear and circular RNAs in mouse preimplantation embryos|ссылка=https://doi.org/10.1186/s13059-015-0706-1|том=16}}</ref> ====
⚫
Клетки обычно лизируют химически, помещая их в {{Не переведено|Лизирующий буфер|лизирующий буфер|en|Lysis buffer}}. Лизирующие буферы могут различаться по качеству сохранения содержимого клетки и эффективности дальнейших процедур, проводимых с лизатом<ref name="10.3389_fonc.2013.00274">{{Статья|автор=David Svec, Daniel Andersson, Milos Pekny, Robert Sjöback, Mikael Kubista, Anders Ståhlberg|год=2013|doi=10.3389/fonc.2013.00274|ISSN=2234-943X|язык=ru|издание=Frontiers in Oncology|заглавие=Direct Cell Lysis for Single-Cell Gene Expression Profiling|ссылка=http://dx.doi.org/10.3389/fonc.2013.00274|том=3}}</ref>
Перечисленные выше подходы с использованием поли(dТ), однако, не позволяют секвенировать неполиаденилированные длнкРНК и кольцевые РНК, а также ограничены эукариотическими клетками. Разработаны альтернативные методы, позволяющие обратно транскрибировать как полиаденилированную, так и неполиаденилированную РНК, например SUPeR-seq.
. Оптимальные протоколы лизиса одиночных клеток [[Эукариоты|эукариот]] и [[Прокариоты|прокариот]] также различны, так как требуется разрушить массивную и часто покрытую защитными оболочками клеточную стенку прокариот, и не повредить выделяемый материал<ref name="10.1016_j.bpj.2018.06.008">{{Статья|автор=Yi Zhang, Jiaxin Gao, Yanyi Huang, Jianbin Wang|год=2018|doi=10.1016/j.bpj.2018.06.008|ISSN=0006-3495|выпуск=2|язык=ru|страницы=173-180|издание=Biophysical Journal|заглавие=Recent Developments in Single-Cell RNA-Seq of Microorganisms|ссылка=http://dx.doi.org/10.1016/j.bpj.2018.06.008|том=115}}</ref>.
Выделение РНК при подготовке образцов происходит не отдельным техническим этапом, а получается за счет использования специальных праймеров для инициации обратной транскрипции<ref name=“10.1186_s13073-017-0467-4” />.
⚫
[[Файл:Схема методов амплификации РНК, применяемых в одноклеточном секвенировании.png|450пкс|Схема методов подготовки библиотек кДНК, применяемых в секвенировании РНК одиночных клеток|альт=|слева]]


=== Получение кДНК<ref name=“10.1016_j.mam.2017.07.003” /> ===
В SUPeR-seq получение первой комплементарной цепи проводят с помощью праймера, 3'-конец которого представляет собой случайную последовательность, а 5'-конец — поли(dT) с праймерной последовательностью. Синтез второй цепи проводят по методу гомополимерного хвоста. Несмотря на отсутствие каких-либо специфических этапов очистки от рибосомальной РНК, SUPeR-seq дает достаточно качественный итоговый продукт амплификации, в котором только 1,5 % прочтений [[Картирование коротких прочтений|картируются]] на последовательности рРНК. Предполагается, что ограниченное количество материала, полученное только из одной клетки, а также некоторые особенности лизиса и обратной транскрипции, используемые в этом методе, не позволяют раскрываться сложной вторичной структуре рРНК, что не дает ей транскрибироваться.
После выделения РНК необходимо получить из нее комплементарную ДНК (кДНК) с помощью обратной транскрипции. Первая цепь кДНК синтезируется при помощи специально спроектированной версии [[Обратная транскриптаза|обратной транскриптазы]] вируса лейкемии мышей M-MuLV<ref name="10.1371_journal.pone.0085270">{{Статья|автор=Pawel Zajac, Saiful Islam, Hannah Hochgerner, Peter Lönnerberg, Sten Linnarsson|год=2013|doi=10.1371/journal.pone.0085270|ISSN=1932-6203|выпуск=12|язык=ru|страницы=e85270|издание=PLoS ONE|заглавие=Base Preferences in Non-Templated Nucleotide Incorporation by MMLV-Derived Reverse Transcriptases|ссылка=http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0085270|том=8}}</ref>. Для инициации синтеза используются праймеры, имеющие в своей последовательности баркоды, иногда уникальные молекулярные идентификаторы и последовательности, позволяющие отобрать интересующую нас фракцию РНК. Обычно нужно избавиться от [[Рибосомные рибонуклеиновые кислоты|рРНК]] и [[Транспортные рибонуклеиновые кислоты|тРНК]], которые составляют до 95 % выделенной тотальной РНК клетки. Этого можно достичь, используя праймеры с поли(dT)-участком, что позволяет выделить [[Полиаденилирование|полиаденилированную]] фракцию. Однако при этом теряется неполиаденилированная РНК (длинные некодирующие РНК и пр.), поэтому в ряде протоколов, например SUPeR-seq, в последовательности праймером после поли(dT)-участка добавляется несколько (5-6) рандомных нуклеотидов.
Синтез второй цепи кДНК осуществляется различными способами. Часто используется метод смены матрицы (англ. template switching), например, в технологиях STRT, Smart-seq и Smart-seq2. Он основан на свойстве ревертазы M-MuLV добавлять на 3’-конец синтезируемой цепи нематричные цитозины<ref name= “10.1371_journal.pone.0085270” />. Соответственно, это делает возможным синтез второй цепи с поли(dG)-праймеров.


[[File:Структура микрочастицы с иммобилизованными праймерами с баркодами и уникальными молекулярными идентификаторами.png|thumb|450пкс|Структура микрочастицы с иммобилизованными праймерами, в последовательности которых зашифрованы клеточные баркоды и уникальные молекулярные идентификаторы (UMI).]]
==== Транскрипция ''in vitro'' (CEL-seq)<ref>{{Статья|автор=Itai Yanai, Noa Sher, Florian Wagner, Tamar Hashimshony|год=2012-09-27|doi=10.1016/j.celrep.2012.08.003|issn=2211-1247|выпуск=3|язык=English|страницы=666–673|издание=Cell Reports|заглавие=CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification|ссылка=https://www.cell.com/cell-reports/abstract/S2211-1247(12)00228-8|том=2}}</ref> ====
В CEL-seq применяется поли(dТ)-праймер со специальным адаптером, баркодом и встроенным [[Промотор (молекулярная генетика)|промотором]] [[Фаг Т4|фага]] Т7. Синтезириованные первые цепи кДНК отбирают на колонке при помощи первого адаптера, а затем амплифицируют путем ''in vitro'' транскрипции. Амплифицированная РНК фрагментируется на куски подходящего для секвенирования размера, к 3’-концам лигируется второй адаптер, а затем РНК конвертируется в кДНК путем обратной транскрипции. кДНК, содержащие оба адаптора, отбираются и амплифицируются с помощью ПЦР.


====Баркоды и уникальные молекулярные идентификаторы <ref name=“10.1016_j.molcel.2018.10.020” /><ref name= “10.1038_s12276-018-0071-8” />====
Этот метод позволяет амплифицировать РНК линейно, а также избежать необходимости смены матрицы, однако он лучше работает с 3’-концом исходного транскрипта, и каждый раунд амплификации приводит к укорачиванию транскрипта во время синтеза второй цепи.
Технология высокопроизволительного секвенирования предполагает совместное секвенирование библиотек, полученных из разных клеток. Поэтому для различения транскриптов, пришедших из каждой конкретной клетки, используются уникальные клеточные баркоды. В экспериментах по дифференциальной экспрессии помимо баркодов используются так называемые уникальные молекулярные идентификаторы (англ. unique molecular identifiers, UMIs). Это последовательность из 4-8 случайных нуклеотидов (например, 5 нуклеотидов дают 4<sup>5</sup>=1024 уникальные последовательности). Сочетание UMI и клеточного баркода статистически получается уникальным для каждого транскрипта, что позволяет сравнивать уровни экспрессии генов по количеству UMI, “пришитых” к транскриптам определенного типа.
Баркоды и уникальные молекулярные идентификаторы вносятся в образец на этапе обратной транскрипции, так как составляют часть праймера для синтеза первой цепи кДНК.


Существует вариация метода — CEL-seq2<ref>{{Статья|автор=Tamar Hashimshony, Naftalie Senderovich, Gal Avital, Agnes Klochendler, Yaron de Leeuw|год=2016-04-28|doi=10.1186/s13059-016-0938-8|issn=1474-760X|выпуск=1|страницы=77|издание=Genome Biology|заглавие=CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq|ссылка=https://doi.org/10.1186/s13059-016-0938-8|том=17}}</ref> — в которой после ''in vitro'' транскрипции проводят дополнительный этап обратной транскрипции амплифицированных РНК, что позволяет улучшить чувствительность.


=== Амплификация кДНК<ref name=“10.1016_j.mam.2017.07.003” /> ===
==== Амплификация по типу катящегося кольца<ref name=":2">{{Статья|автор=Xinghua Pan, Russell E. Durrett, Haiying Zhu, Yoshiaki Tanaka, Yumei Li|год=2013-01-08|doi=10.1073/pnas.1217322109|issn=1091-6490|выпуск=2|страницы=594–599|издание=Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America|заглавие=Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23267071|том=110}}</ref> ====
В ряд технологий, таких как MARS-seq, CEL-seq и CEL-seq2, для амплификации кДНК используется <i>in vitro</i> транскрипция (англ. <i>in vitro</i> transcription, IVT). Это способ основан на транскрипции кДНК фаговой полимеразой Т7 и повторении этапа обратной транскрипции. Для осуществления <i>in vitro</i> транскрипции в поли(dT)-праймер вносится [[Промотор|промотор]] Т7. Увеличение количества кДНК в данном случае происходит линейно.
{{См. также|Репликация по типу катящегося кольца}}
Амплификация кДНК может также осуществляться с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), например, в Drop-seq, SCRB-seq, SMART-seq и SMART-seq2. Однако этот метод часто вносит искажения в отношение количества транскриптов. С этими искажениями позволяет бороться использование уникальных молекулярных идентификаторов.
Амплификация по типу катящегося кольца позволяет создавать кДНК библиотеки одиночных клеток [[Прокариоты|прокариот]]<ref>{{Статья|автор=Yun Kang, Michael H. Norris, Jan Zarzycki-Siek, William C. Nierman, Stuart P. Donachie|год=2011-6|doi=10.1101/gr.116103.110|issn=1549-5469|выпуск=6|страницы=925–935|издание=Genome Research|заглавие=Transcript amplification from single bacterium for transcriptome analysis|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21536723|том=21}}</ref> и эукариот<ref name=":2" />. Для этого РНК обратно транскрибируется, одноцепочечные кДНК разводятся до низкой концентрации (чтобы преобладали внутримолекулярные реакции), замыкаются в кольцо с помощью специальной [[лигазы]] и амплифицируются путем ПЦР с ДНК-полимеразой из бактериофага Ф29 и случайными праймерами с первой адаптерной последовательностью. Получившиеся ампликоны подвергают фрагментации для получения подходящих для секвенирования длин фрагментов и лигируют к ним второй адаптер.
Для работы с прокариотическими клетками используются также специальные методы, такие как амплификация по типу [[Репликация по типу катящегося кольца|катящегося кольца]] <ref name="10.1016_j.bpj.2018.06.008" />.


===Подготовка геномной библиотеки и секвенирование<ref name=“10.1016_j.mam.2017.07.003” /><ref name=“10.1038_s12276-018-0071-8” />===
=== Использование молекулярных штрихкодов ===
В зависимости от способа подготовки библиотеки происходит секвенирование полноразмерных транскриптов, или фракции, обогащенной 3’- или 5’-фрагментами. Обогащение полноразмерными транскриптами (технологии SMART-seq,SMART-seq2) требуется при изучении альтернативного сплайсинга, [[Однонуклеотидный полиморфизм|однонуклеотидных полиморфизмов]]. Тогда как секвенирование 3’-фрагментов (технологии CEL- seq, CEL-seq2, MARS-seq) и 5’-фрагментов (технология STRT) подходят для выявления дифференциальной экспрессии. Эти методы как правило используют уникальные молекулярные идентификаторы.
При подготовке библиотек для секвенирования транскриптомов одиночных клеток возникает ряд проблем, связанных с тем, что в клетках достаточно мало РНК-матрицы для синтеза кДНК. Это приводит к тому, что после множества стадий амплификации возникает искажение реального числа транкриптов в исследуемых клетках. Решением этой проблемы стали {{Не переведено|Уникальный молекулярный идентификатор|уникальные молекулярные идентификаторы|en|Unique molecular identifier}} — короткие случайные последовательности, встраиваемые в олиго(dТ)-праймер на стадии обратной транскрипции (дополнительно к баркодам, необходимым для идентификации прочтений, пришедших из одной клетки)<ref>{{Статья|автор=Sten Linnarsson, Peter Lönnerberg, Maria Kasper, Pawel Zajac, Gioele La Manno|год=2014-02|doi=10.1038/nmeth.2772|issn=1548-7105|выпуск=2|язык=en|страницы=163–166|издание=Nature Methods|заглавие=Quantitative single-cell RNA-seq with unique molecular identifiers|ссылка=https://www.nature.com/articles/nmeth.2772|том=11}}</ref>. Дальнейший анализ проводится именно с числом различных уникальных молекулярных идентификаторов гена на клетку, а не покрытием гена.
Подготовленные библиотеки обрабатывают [[Методы секвенирования нового поколения|методами секвенирования нового поколения]] (англ. next generation sequencing, NGS), часто используется секвенироваие на платформе [[Illumina|Illumina]]. Полученные “сырые” прочтения обрабатывают методами биоинформатики.


== Анализ данных ==
== Анализ данных ==

Версия от 11:05, 3 мая 2020

Транскриптомика одиночных клеток (англ. single-cell transcriptomics) — область биологических исследований, в которой основным инструментом служат методы количественного анализа экспрессии генов в индивидуальных клетках. Изучение транскриптома отдельных клеток позволяет решить проблему «усреднённых» данных, которые получаются при анализе тотальной РНК, выделенной из всего образца[1]. Секвенирование РНК одиночных клеток сделало возможными анализ клеточного многообразия в популяциях клеток, считавшихся ранее однородными, например, были получены новые данные в областях иммунологических, эмбриологических и онкологических исследованиях[2][3][4]. Развитие технологий с 2009, когда впервые было произведено секвенирование транскриптома одиночных клеток, по наше время позволило увеличить производительность эксперимента от штук до сотен тысяч клеток, что существенно повысило точность получаемых данных[5].

Появление новых технологий секвенирования РНК единичных клеток позволило существенно увеличить количество клеток в эксперименте.[5]
* 2009 - Впервые проведено секвенирование РНК отдельных клеток.
* 2010 - Количество клеток в эксперименте увеличено до ~100 за счет параллельной обработки образцов.
* 2011 - Технология STRT-Seq: улучшенное покрытие 5' конца[6].
* 2012 - Технология SMART-Seq: амплификация с полным покрытием[7], технология CEL-seq - избавление от систематических ошибок при ПЦР с помощью in vitro транскрипции.
* 2013 - Технологии SMART-Seq2 - удешевление процесса, улучшенная чувствительность. Секвенирование на коммерческой платформе Fluidigm C1 с использованием микрочастиц жидкости позволило увеличить количество клеток в эксперименте до ~1000[7].
* 2014 - Появление технологий с использованием уникальных молекулярных идентификаторов (англ. UMI): MARS-Seq, CEL-Seq UMI, STRT-Seq UMI[8].
* 2015 - Технологии CytoSeq, Drop-seq, inDrop: увеличение производительности до сотен клеток за счет использования наночастиц жидкости и иммобилизованных праймеров[9].
* 2017 - усовершенствование технологий, in situ баркодирование. Производительность увеличена до ~1000000 клеток.

Технология секвенирования РНК отдельных клеток

Схема эксперимента секвенирования РНК одиночных клеток

Общий алгоритм секвенирования РНК одиночных клеток включает в себя 8 последовательных этапов[10]:

  1. Выделение единичных клеток.
  2. Лизис единичных клеток.
  3. Выделение интересующей нас фракции РНК с помощью специальных праймеров.
  4. Синтез кДНК с помощью обратной транскрипции.
  5. Амплификация кДНК.
  6. Подготовка библиотеки кДНК.
  7. Секвенирование.
  8. Биоинформатическая обработка полученных прочтений и анализ данных.

Различные методы подготовки библиотек для секвенирования РНК одиночных клеток отличаются по своей специфичности, точности, стоимости и другим параметрам. Например, Smart-seq2 отличается высокой чувствительностью, а Drop-seq и другие микрофлюидные технологии с использованием микрочастиц высокопроизводительны[11][9].

Методы разделения одиночных клеток для single-cell RNA-seq.
Методы разделения одиночных клеток для single-cell RNA-seq.

Выделение отдельных клеток

Перед разделением клеток нужно прервать контакты между ними и избавиться от межклеточного вещества. Это может быть достигнуто с помощью ферментирования образца ткани, а также путем специфических манипуляций, таких как, например, лазерная захватывающая микродиссекция [6], которая позволяет выделять клетки из образца твердой ткани с помощью лазера. После получения клеточной суспензии клетки разделяют с помощью различных методов[7].

  • Метод предельного разбавления (англ. limiting dilution). Этот метод заключается в том, что из разбавленной клеточной суспензии пипеткой выделяются отдельные клетки. Процедура производится вручную.
  • Микроманипуляция (англ. micromanipulation). Это метод ручного выделения клеток из ткани под под микроскопом. Он обычно используется для выделения клеток ранних эмбрионов или отбора клеток некультивируемых микроорганизмов.
Файл:Методы разделения одиночных клеток для single-cell секвенирования.png
Методы разделения одиночных клеток для single-cell секвенирования.
  • сортировка флуоресцентно активированных клеток[англ.] (англ. fluorescence-activated cell sorting (FACS)). Это часто используемый высокопроизводительный метод. Перед сортировкой клетки метят с помощью моноклональных антител к поверхностным маркерам, антитела снабжены флуоресцентными метками.
    Механическая сортировка происходит следующим образом. Суспензию клеток помещают в прибор, который выбрасывает капли, содержащие по одной клетке, через наконечник специального “распылителя”. Эти капли проходят через луч лазера, и, в зависимости от типа флуоресцентной метки (или их совокупности) на клетке, капля получает заряд, который заставляет ее притягиваться к одной из отклоняющих пластин, в результате чего она попадает в конкретный собирающий сосуд. Возможно также производить негативный отбор - выделять клетки не несущие маркеров.
    Данный метод не позволяет работать с образцами малого объема (требуется подавать на вход около 10000 клеток) и требует наличия антител к поверхностным белкам.
  • Микрюфлюидные технологии[12] (англ. microfluidic technology). Это также высокопроизводительный метод, использующийся наряду с FACS. Он основан на изоляции клеток в микрокаплях буфера, погруженных в гидрофобную среду (масло). Разделение происходит в трубках, диаметр которых подобран так, чтобы капли, содержащие клетки не сливались друг с другом. Капля раствора в которую помещается таким образом клетка содержит реакционную смесь для лизиса, выделения РНК и синтеза кДНК. Такой принцип используется в коммерческом аппарате Fluidigm C1 и позволяет обрабатывать до 1000 клеток параллельно.
  • Микрофлюидные технологии с использованием микрочастиц (англ. microdroplet-based microfluidics). Другой похожий принцип также основан на изоляции клеток в гидрофильных микрочастицах жидкости в гидрофобной среде, но помимо клеток в каплю попадает также твердая микрочастица с иммобилизированными на ней праймерами. Так же как и в предыдущем случае в каплях содержатся изолированные клетки, лизирующий буфер и реакционная смесь для обратной транскрипции, в том числе изолированные на микрочастицах праймеры. Этот метод используется в коммерческом аппарате Chromium system from 10× Genomics. Он позволяет работать с каплями меньшего объема, чем микрофлюидные технологии без микрочастиц, и обрабатывать от 1000 до 1000000 клеток.
  • Микрофлюидные технологии с использованием микроячеек. Данный метод основан на распределении клеток по ячейкам такого размера, который допускает попадание в них не более одной клетки и микрочастицы с иммобилизованными праймерами[12].
  • Некоторые специфические задачи требуют выделения из популяции очень малочисленных клеток. Например, выделение из крови циркулирующих опухолевых клеток (англ. circulating tumor cells, CTCs) производится с помощью добавления к образцу крови антител с магнитными частицами и выделения меченых клеток с помощью магнита. Для опухолевых клеток эпителиального происхождения используются антитела к CD45− и EpCAM+.

Лизис клеток и выделение РНК

Клетки обычно лизируют химически, помещая их в лизирующий буфер[англ.]. Лизирующие буферы могут различаться по качеству сохранения содержимого клетки и эффективности дальнейших процедур, проводимых с лизатом[13] . Оптимальные протоколы лизиса одиночных клеток эукариот и прокариот также различны, так как требуется разрушить массивную и часто покрытую защитными оболочками клеточную стенку прокариот, и не повредить выделяемый материал[14]. Выделение РНК при подготовке образцов происходит не отдельным техническим этапом, а получается за счет использования специальных праймеров для инициации обратной транскрипции[10].

Схема методов подготовки библиотек кДНК, применяемых в секвенировании РНК одиночных клеток

Получение кДНК[15]

После выделения РНК необходимо получить из нее комплементарную ДНК (кДНК) с помощью обратной транскрипции. Первая цепь кДНК синтезируется при помощи специально спроектированной версии обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей M-MuLV[16]. Для инициации синтеза используются праймеры, имеющие в своей последовательности баркоды, иногда уникальные молекулярные идентификаторы и последовательности, позволяющие отобрать интересующую нас фракцию РНК. Обычно нужно избавиться от рРНК и тРНК, которые составляют до 95 % выделенной тотальной РНК клетки. Этого можно достичь, используя праймеры с поли(dT)-участком, что позволяет выделить полиаденилированную фракцию. Однако при этом теряется неполиаденилированная РНК (длинные некодирующие РНК и пр.), поэтому в ряде протоколов, например SUPeR-seq, в последовательности праймером после поли(dT)-участка добавляется несколько (5-6) рандомных нуклеотидов. Синтез второй цепи кДНК осуществляется различными способами. Часто используется метод смены матрицы (англ. template switching), например, в технологиях STRT, Smart-seq и Smart-seq2. Он основан на свойстве ревертазы M-MuLV добавлять на 3’-конец синтезируемой цепи нематричные цитозины[17]. Соответственно, это делает возможным синтез второй цепи с поли(dG)-праймеров.

Файл:Структура микрочастицы с иммобилизованными праймерами с баркодами и уникальными молекулярными идентификаторами.png
Структура микрочастицы с иммобилизованными праймерами, в последовательности которых зашифрованы клеточные баркоды и уникальные молекулярные идентификаторы (UMI).

Баркоды и уникальные молекулярные идентификаторы [18][19]

Технология высокопроизволительного секвенирования предполагает совместное секвенирование библиотек, полученных из разных клеток. Поэтому для различения транскриптов, пришедших из каждой конкретной клетки, используются уникальные клеточные баркоды. В экспериментах по дифференциальной экспрессии помимо баркодов используются так называемые уникальные молекулярные идентификаторы (англ. unique molecular identifiers, UMIs). Это последовательность из 4-8 случайных нуклеотидов (например, 5 нуклеотидов дают 45=1024 уникальные последовательности). Сочетание UMI и клеточного баркода статистически получается уникальным для каждого транскрипта, что позволяет сравнивать уровни экспрессии генов по количеству UMI, “пришитых” к транскриптам определенного типа. Баркоды и уникальные молекулярные идентификаторы вносятся в образец на этапе обратной транскрипции, так как составляют часть праймера для синтеза первой цепи кДНК.


Амплификация кДНК[15]

В ряд технологий, таких как MARS-seq, CEL-seq и CEL-seq2, для амплификации кДНК используется in vitro транскрипция (англ. in vitro transcription, IVT). Это способ основан на транскрипции кДНК фаговой полимеразой Т7 и повторении этапа обратной транскрипции. Для осуществления in vitro транскрипции в поли(dT)-праймер вносится промотор Т7. Увеличение количества кДНК в данном случае происходит линейно. Амплификация кДНК может также осуществляться с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), например, в Drop-seq, SCRB-seq, SMART-seq и SMART-seq2. Однако этот метод часто вносит искажения в отношение количества транскриптов. С этими искажениями позволяет бороться использование уникальных молекулярных идентификаторов. Для работы с прокариотическими клетками используются также специальные методы, такие как амплификация по типу катящегося кольца [14]. 

===Подготовка геномной библиотеки и секвенирование[15][19]===

В зависимости от способа подготовки библиотеки происходит секвенирование полноразмерных транскриптов, или фракции, обогащенной 3’- или 5’-фрагментами. Обогащение полноразмерными транскриптами (технологии SMART-seq,SMART-seq2) требуется при изучении альтернативного сплайсинга, однонуклеотидных полиморфизмов. Тогда как секвенирование 3’-фрагментов (технологии CEL- seq, CEL-seq2, MARS-seq) и 5’-фрагментов (технология STRT) подходят для выявления дифференциальной экспрессии. Эти методы как правило используют уникальные молекулярные идентификаторы. Подготовленные библиотеки обрабатывают методами секвенирования нового поколения (англ. next generation sequencing, NGS), часто используется секвенироваие на платформе Illumina. Полученные “сырые” прочтения обрабатывают методами биоинформатики.

Анализ данных

Различные этапы исследования РНК отдельных клеток, на которых применяются методы биоинформатики[20]
А. Контроль качества результатов эксперимента
Б. Примеры исследования гетерогенных популяций клеток: разные клеточные типы, спектр состояний клеток в ткани, спектр состояний клеток при развитии или ином биологическом процессе
В. Анализ источников и уровня шума: биологического и технического

Первоочередной задачей при биоинформатическом анализе результатов секвенирования РНК одиночных клеток является получение матрицы экспрессий генов из прочтений секвенатора. После получения такой матрицы имеют место несколько направлений анализа[20]:

  1. Анализ на клеточном уровне: кластеризация, классификация и определение клеточных траекторий.
  2. Анализ на уровне генов: определение дифференциально экспрессирующихся генов, регуляторных сетей.

Получение матрицы экспрессии генов

Стандартный протокол обработки прочтений, получаемых при секвенировании, включает в себя несколько шагов[21]:

  1. Контроль качества прочтений (FastQC).
  2. Картирование прочтений на референсный геном (TopHat2[22], HISAT[23] и др.).
  3. Подсчёт количества транскриптов исследуемых генов для каждой из клеток (используя характеристики покрытия FPKM/TPM[англ.] или число уникальных молекулярных идентификаторов).
  4. При необходимости (например, если два набора данных были получены в разных местах и разными людьми) — поправка систематической ошибки (kBET[24]).
  5. В случае, если использовался протокол без уникальных молекулярных идентификаторов, необходима нормализация матрицы (SCnorm[25], SAMstrt[26]).
  6. Восстановление пропущенных данных (импутация[англ.]) (MAGIC[27], Autoimpute[28]).
Нормированная и центрированная матрица генной экспрессии. Строки — это анализируемые гены, столбцы — это анализируемые клетки. Цветом условно изображен уровень экспрессии гена в клетке.
Иерархическая кластеризация клеток по профилям экспрессии генов

Кластеризация

С целью выявления клеточных субпопуляций обычно проводится кластеризация клеток по схожести их профилей экспрессии генов[29]. Эта кластеризация может проводиться многими способами: методом k-средних[30], с использованием графа ближайших соседей[31], иерархической кластеризацией[32] и некоторыми другими. Несмотря на обилие подходов, кластеризация получается не всегда: структура данных может скрываться за техническим шумом или систематическими ошибками[33][34]; также анализ затрудняется из-за проклятия размерности. Для сглаживания этих эффектов размерность транскриптомного пространства, элементами которого являются клетки, понижается.

Примеры результатов снижения размерности с использованием метода главных компонент (слева) и алгоритма t-SNE (справа) на одинаковых данных

Уменьшение размерности

При выполнении формальных математических операций классификации, поиска корреляций принимается, что каждая клетка — это вектор в n-мерном пространстве, где n соответствует числу анализируемых генов, а координаты клетки — это уровни экспрессий соответствующих генов в ней[35]. Как уже было сказано, снижение размерности может помочь восстановить структуру данных и уменьшить шумы, и потому размерность векторов экспрессий имеет смысл понижать (при помощи метода главных компонент[36], t-SNE[37], многомерного шкалирования[38], UMAP[39] и других).

Дифференциальная экспрессия генов

Важной задачей является поиск дифференциально экспрессирующихся генов, то есть таких генов, которые статистически достоверно экспрессируются в разных группах клеток с разной силой. Такие гены часто характеризуют особенности рассматриваемых клеток и являются их маркерами[21]. Сначала для идентификации дифференциальной экспрессии использовали инструменты, созданные для работы с транскриптомикой тканей и органов; сейчас существует ряд методов (MAST[40], SCDE[41]), созданных для поиска дифференциальной экспрессии в данных секвенирования именно отдельных клеток.

Применение

Генные регуляторные сети

Генная регуляторная сеть[англ.] — это совокупность молекулярных регуляторов, взаимодействующих друг с другом и другими веществами в клетке, регулируя уровни экспрессии[42]. Эти регуляторы играют центральную роль в морфогенезе частей тела и органов живых организмов и являются одним из центральных предметов изучения эволюционной биологии развития. Генную регуляторную сеть можно представить как граф, в котором вершины — это гены, а рёбра — это их ко-регуляция. Существуют методы, определяющие регуляторные сети при помощи поиска корреляций между экспрессиями генов, однако такой подход не позволяет детектировать нелинейные взаимодействия, поэтому сейчас возникли подходы, основанные на машинном обучении[43], вероятностных моделях[44], а также теории информации[45].

Поиск траекторий дифференцировок клеток

Клетки постоянно находятся в динамических процессах и реагируют на различные воздействия окружающей среды. Эти процессы сопровождаются и изменением профиля транскрипции клетки. Сама постановка эксперимента по секвенированию РНК одиночных клеток позволяет захватывать клетки в их разные стадии дифференцировки. Когда промежуточных стадий отсеквенировано достаточно много, можно отследить путь дифференцировки клетки в транскриптомном пространстве в течение «псевдовремени»[46]. Этот инструментарий помогает изучать механизмы онтогенеза в частности и формирования различий в общем. Сейчас существует множество различных подходов к реконструкции таких траекторий[47].

Исследования дифференцировки стволовых клеток

Отличия между отдельными клетками — фундаментальная характеристика популяций стволовых клеток, но эти отличия размываются при традиционном анализе ансамблей клеток. Секвенирование РНК одиночных клеток позволяет выявлять эти отличия и обнаруживать различные фенотипы стволовых клеток даже в пределах «однородной» популяции.

Так, были выявлены значительные различия между долгоживущими и короткоживущими гематопоэтическими стволовыми клетками мыши и определено, что основной вклад в эти различия вносят гены, отвечающие за клеточный цикл[48][49]. Секвенирование РНК одиночных клеток было применено для изучения лёгких мыши[50] и позволило найти ранее неизвестные маркеры, специфичные для различных подтипов клеток. Были также исследованы нейронные стволовые клетки[англ.] различных видов и их траектории развития[51]. В другом исследовании было проведено сравнение смен стадий нейронных стволовых клеток у здоровых мышей и мышей, перенёсших ишемию головного мозга[англ.][52].

Исследования эмбриогенеза

Процесс эмбрионального развития можно рассматривать как переход от уровня отдельных клеток к уровню организма. Для изучения ранних стадий эмбрионального развития необходимы методы, способные работать с небольшим количеством доступных клеток. С помощью секвенирования РНК одиночных клеток удалось провести общий анализ раннего развития млекопитающих[53][54][55]. Были получены профили экспрессии генов для клеток человека и мыши периода предимплантационного развития[56][57], а также для первичных половых клеток человека в период перехода от стадии миграции к стадии гонад[58]. На клетках мышиных эмбрионов были изучены изменения экспрессии генов в период материнско-зиготического перехода[англ.][59][60] (процесс замены зародышем материнских мРНК на свои собственные). Было показано, что в эмбрионе мыши активация зиготического генома происходит на стадии 4 клеток, у человека — между четырёх- и восьмиклеточной стадиями[57]. Для нематоды c. elegans был составлен молекулярный атлас её эмбрионального развития с клеточным разрешением[61].

Анализ тканей

Изучение транскриптома всех клеток ткани даёт возможность узнать больше о иерархии клеточных линий с непревзойдённой точностью. Параллельные исследования транскриптомики отдельных клеток селезёнки без предварительного отбора клеток, основанного на заранее выбранных клеточных маркерах, в сочетании с иерархической кластеризацией позволило воссоздать общую структуру взаимоотношений клеточных линий селезёнки[62].

Онкологические исследования

Ткань злокачественной опухоли обычно состоит из нескольких популяций клеток, отличающихся друг от друга функционально и фенотипически. Согласно современным представлениям, процесс развития опухоли может иметь в своей основе не только клональную эволюцию мутировавших клеток исходной ткани, но и иерархическую дифференцировку так называемых раковых стволовых клеток[англ.] (РСК). Согласно концепции РСК, любое злокачественное новообразование развивается из одной клетки-предшественника популяции РСК, а опухоль устроена иерархически, то есть разные типы раковых клеток обладают разной способностью к делению[63]. Секвенирование РНК одиночных клеток позволяет выявлять отдельные РСК, а также анализировать различные популяции клеток, находящиеся в одной опухоли.

Так, недавно были проанализированы транскриптомные профили сотен отдельных опухолевых клеток пяти пациентов с глиобластомой, что позволило выявить дифференциальную экспрессию генов, связанных с онкогенным сигнализированием, пролиферацией, комплементным и иммунным ответом и гипоксией. Также были обнаружены клетки с фенотипами, промежуточными между мезенхимальным и эпителиальным, что не соответствует классической модели эпителиально-мезенхимального перехода с двумя дискретными состояниями клеток. Кроме того, был получен набор генов «стволовости», и клетки также распределялись по непрерывной, а не дискретной шкале уровней экспрессии этих генов, что отражает сложный характер системы стволовых клеток в опухоли[64].

На данный момент существует несколько моделей метастазирования, таких как позднее распространение, ранний сев и самосев, однако до сих пор сложно объяснить ими метастазирование в большинстве видов рака у человека. Трудности заключаются как в упомянутой выше гетерогенности клеток в пределах самой опухоли, так и в сложности анализа ключевых агентов метастазирования — циркулирующих опухолевых клеток[англ.](ЦОК): эти клетки исключительно редко встречаются в крови (одна на миллион).

Тем не менее, в недавнем исследовании с помощью секвенирования РНК одиночных клеток удалось выявить три различные генетические подписи в ЦОК, ассоциированные с метастазированием, у пациентов с меланомой[65] . В другом исследовании изучалось распространение отдельных циркулирующих опухолевых клеток и их кластеров в метастатическом раке молочной железы человека, в том числе с использованием мышиных моделей. Было показано, что кластеры имеют повышенный метастатический потенциал по сравнению с отдельными ЦОК, а также что плакоглобин[англ.] регулирует образование таких кластеров[66]. Исследование отдельных ЦОК метастатического рака поджелудочной железы показало, что эти клетки экспрессируют особые собственные белки внеклеточного матрикса[67]. Подобные результаты позволяют лучше понять функционирование РСК и генетические взаимосвязи между клетками исходной опухоли и метастазов.

Отдельная тема онкологических исследований — приобретение клетками опухоли устойчивости к химиотерапии. Этот процесс также до сих пор плохо изучен для большинства видов рака у человека. В одном из последних исследований были проанализированы транскриптомные профили нескольких сотен отдельных клеток клеточной линии аденокарциномы лёгкого и выявлены новые сигнальные пути, ассоциированные с устойчивостью к определённым компонентам химиотерапии[68]. Исследование ЦОК рака предстательной железы выявило активацию неканонического сигнального пути Wnt, способствующую устойчивости к лекарствам на основе антиандрогена[69].

Исследования альтернативного сплайсинга

Большинство генов эукариот подвержены альтернативному сплайсингу — явлению, позволяющему комбинировать экзоны гена в разных комбинациях, вследствие чего с одного гена появляется возможность производить различные транскрипты и, следовательно, различные белки с потенциально разными функциями. Несмотря на то, что некоторые методы секвенирования РНК одиночных клеток (например, SMART-Seq) имеют близкое к полному покрытие транскриптома, анализ альтернативных изоформ затруднён из-за перечисленных ранее ограничений методов. Например, транскрипты, присутствующие в малом количестве, могут быть не обнаружены из-за неотличимости от биологического шума. Однако, уже разрабатываются модели, учитывающие распределения транскриптов в объединённом множестве отдельно секвенированных клеток[70][71]. Они позволят точнее предсказывать число различных изоформ в отдельных клетках.

Иммунология

Секвенирование РНК одиночных клеток может использоваться для эффективного анализа иммунного ответа клеток одной популяции, находящихся в разных условиях. Так, в недавнем исследовании изучалась динамика взаимодействия макрофагов сальмонеллы с клетками-хозяевами c различными модификациями липополисахаридов (основного компонента клеточной стенки)[72]. В другом исследовании изучалась реакция на липополисахариды дендритных клеток костного мозга мышей[73].

Смотрите также

Примечания

  1. ↑ Ashraful Haque, Jessica Engel, Sarah A. Teichmann, Tapio Lönnberg. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications // Genome Medicine. — 2017. — Т. 9, вып. 1. — ISSN 1756-994X. — doi:10.1186/s13073-017-0467-4.
  2. ↑ Amy E. Herr, Takehiko Kitamori, Ulf Landegren, Masood Kamali-Moghaddam. Next wave advances in single-cell analyses // The Analyst. — 2019. — Т. 144, вып. 3. — С. 735-737. — ISSN 0003-2654,1364-5528. — doi:10.1039/c9an90011j.
  3. ↑ Haide Chen, Fang Ye, Guoji Guo. Revolutionizing immunology with single-cell RNA sequencing // Cellular & Molecular Immunology. — 2019. — Т. 16, вып. 3. — С. 242-249. — ISSN 1672-7681,2042-0226. — doi:10.1038/s41423-019-0214-4.
  4. ↑ Pavithra Kumar, Yuqi Tan, Patrick Cahan. Understanding development and stem cells using single cell-based analyses of gene expression // Development. — 2017. — Т. 144, вып. 1. — С. 17-32. — ISSN 0950-1991,1477-9129. — doi:10.1242/dev.133058.
  5. ↑ 1 2 Valentine Svensson, Roser Vento-Tormo, Sarah A Teichmann. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade // Nature Protocols. — 2018. — Т. 13, вып. 4. — С. 599-604. — ISSN 1754-2189,1750-2799. — doi:10.1038/nprot.2017.149.
  6. ↑ 1 2 Eva Hedlund, Qiaolin Deng. Single-cell RNA sequencing: Technical advancements and biological applications // Molecular Aspects of Medicine. — 2017. — Т. 59. — С. 36-46. — ISSN 0098-2997. — doi:10.1016/j.mam.2017.07.003.
  7. ↑ 1 2 3 Byungjin Hwang, Ji Hyun Lee, Duhee Bang. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines // Experimental & Molecular Medicine. — 2018. — Т. 50, вып. 8. — ISSN 2092-6413. — doi:10.1038/s12276-018-0071-8.
  8. ↑ Aleksandra A. Kolodziejczyk, Jong Kyoung Kim, Valentine Svensson, John C. Marioni, Sarah A. Teichmann. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing // Molecular Cell. — 2015. — Т. 58, вып. 4. — С. 610-620. — ISSN 1097-2765. — doi:10.1016/j.molcel.2015.04.005.
  9. ↑ 1 2 Xiannian Zhang, Tianqi Li, Feng Liu, Yaqi Chen, Jiacheng Yao, Zeyao Li, Yanyi Huang, Jianbin Wang. Comparative Analysis of Droplet-Based Ultra-High-Throughput Single-Cell RNA-Seq Systems // Molecular Cell. — 2018. — Т. 73, вып. 1. — С. 130-142.e5. — ISSN 1097-2765. — doi:10.1016/j.molcel.2018.10.020.
  10. ↑ 1 2 Ошибка в сносках?: Неверный тег <ref>; для сносок “10.1186_s13073-017-0467-4” не указан текст
  11. ↑ Christoph Ziegenhain, Beate Vieth, Swati Parekh, Björn Reinius, Amy Guillaumet-Adkins, Martha Smets, Heinrich Leonhardt, Holger Heyn, Ines Hellmann, Wolfgang Enard. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods // Molecular Cell. — 2017. — Т. 65, вып. 4. — С. 631-643.e4. — ISSN 1097-2765. — doi:10.1016/j.molcel.2017.01.023.
  12. ↑ 1 2 Dan Gao, Feng Jin, Min Zhou, Yuyang Jiang. Recent advances in single cell manipulation and biochemical analysis on microfluidics // The Analyst. — 2018. — Т. 144, вып. 3. — С. 766-781. — ISSN 0003-2654,1364-5528. — doi:10.1039/c8an01186a.
  13. ↑ David Svec, Daniel Andersson, Milos Pekny, Robert Sjöback, Mikael Kubista, Anders Ståhlberg. Direct Cell Lysis for Single-Cell Gene Expression Profiling // Frontiers in Oncology. — 2013. — Т. 3. — ISSN 2234-943X. — doi:10.3389/fonc.2013.00274.
  14. ↑ 1 2 Yi Zhang, Jiaxin Gao, Yanyi Huang, Jianbin Wang. Recent Developments in Single-Cell RNA-Seq of Microorganisms // Biophysical Journal. — 2018. — Т. 115, вып. 2. — С. 173-180. — ISSN 0006-3495. — doi:10.1016/j.bpj.2018.06.008.
  15. ↑ 1 2 3 Ошибка в сносках?: Неверный тег <ref>; для сносок “10.1016_j.mam.2017.07.003” не указан текст
  16. ↑ Pawel Zajac, Saiful Islam, Hannah Hochgerner, Peter Lönnerberg, Sten Linnarsson. Base Preferences in Non-Templated Nucleotide Incorporation by MMLV-Derived Reverse Transcriptases // PLoS ONE. — 2013. — Т. 8, вып. 12. — С. e85270. — ISSN 1932-6203. — doi:10.1371/journal.pone.0085270.
  17. ↑ Ошибка в сносках?: Неверный тег <ref>; для сносок “10.1371_journal.pone.0085270” не указан текст
  18. ↑ Ошибка в сносках?: Неверный тег <ref>; для сносок “10.1016_j.molcel.2018.10.020” не указан текст
  19. ↑ 1 2 Ошибка в сносках?: Неверный тег <ref>; для сносок “10.1038_s12276-018-0071-8” не указан текст
  20. ↑ 1 2 Duhee Bang, Ji Hyun Lee, Byungjin Hwang. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines (англ.) // Experimental & Molecular Medicine. — 2018-08-07. — Vol. 50, iss. 8. — P. 96. — ISSN 2092-6413. — doi:10.1038/s12276-018-0071-8.
  21. ↑ 1 2 Tieliu Shi, Baitang Ning, Geng Chen. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis (англ.) // Frontiers in Genetics. — 2019. — Т. 10. — ISSN 1664-8021. — doi:10.3389/fgene.2019.00317.
  22. ↑ Daehwan Kim, Geo Pertea, Cole Trapnell, Harold Pimentel, Ryan Kelley. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions // Genome Biology. — 2013-04-25. — Т. 14, вып. 4. — С. R36. — ISSN 1474-760X. — doi:10.1186/gb-2013-14-4-r36.
  23. ↑ Steven L. Salzberg, Ben Langmead, Daehwan Kim. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements (англ.) // Nature Methods. — 2015-04. — Vol. 12, iss. 4. — P. 357–360. — ISSN 1548-7105. — doi:10.1038/nmeth.3317.
  24. ↑ Fabian J. Theis, Sarah A. Teichmann, F. Alexander Wolf, Zhichao Miao, Maren Büttner. A test metric for assessing single-cell RNA-seq batch correction (англ.) // Nature Methods. — 2019-01. — Vol. 16, iss. 1. — P. 43–49. — ISSN 1548-7105. — doi:10.1038/s41592-018-0254-1.
  25. ↑ Rhonda Bacher, Li-Fang Chu, Ning Leng, Audrey P Gasch, James A Thomson. SCnorm: robust normalization of single-cell RNA-seq data (англ.) // Nature Methods. — 2017-6. — Vol. 14, iss. 6. — P. 584–586. — ISSN 1548-7105 1548-7091, 1548-7105. — doi:10.1038/nmeth.4263.
  26. ↑ Juha Kere, Sten Linnarsson, Virpi Töhönen, Shintaro Katayama. SAMstrt: statistical test for differential expression in single-cell transcriptome with spike-in normalization (англ.) // Bioinformatics. — 2013-11-15. — Vol. 29, iss. 22. — P. 2943–2945. — ISSN 1367-4803. — doi:10.1093/bioinformatics/btt511.
  27. ↑ Dana Pe’er, Smita Krishnaswamy, Guy Wolf, Linas Mazutis, Brian Bierie. Recovering Gene Interactions from Single-Cell Data Using Data Diffusion (англ.) // Cell. — 2018-07-26. — Т. 174, вып. 3. — С. 716–729.e27. — ISSN 1097-4172 0092-8674, 1097-4172. — doi:10.1016/j.cell.2018.05.061.
  28. ↑ Angshul Majumdar, Debarka Sengupta, Aanchal Mongia, Divyanshu Talwar. AutoImpute: Autoencoder based imputation of single-cell RNA-seq data (англ.) // Scientific Reports. — 2018-11-05. — Vol. 8, iss. 1. — P. 16329. — ISSN 2045-2322. — doi:10.1038/s41598-018-34688-x.
  29. ↑ Vasilis Ntranos, Govinda M. Kamath, Jesse M. Zhang, Lior Pachter, David N. Tse. Fast and accurate single-cell RNA-seq analysis by clustering of transcript-compatibility counts // Genome Biology. — 2016-05-26. — Т. 17, вып. 1. — С. 112. — ISSN 1474-760X. — doi:10.1186/s13059-016-0970-8.
  30. ↑ Aviv Regev, Alexander F. Schier, David Gennert, Jeffrey A. Farrell, Rahul Satija. Spatial reconstruction of single-cell gene expression data (англ.) // Nature Biotechnology. — 2015-05. — Vol. 33, iss. 5. — P. 495–502. — ISSN 1546-1696. — doi:10.1038/nbt.3192.
  31. ↑ Amos Tanay, Aviezer Lifshitz, Michael Hoichman, Zohar Meir, Elad Chomsky. MetaCell: analysis of single cell RNA-seq data using k-NN graph partitions (англ.) // bioRxiv. — 2018-10-08. — P. 437665. — doi:10.1101/437665.
  32. ↑ Jesse M. Zhang, Jue Fan, H. Christina Fan, David Rosenfeld, David N. Tse. An interpretable framework for clustering single-cell RNA-Seq datasets // BMC Bioinformatics. — 2018-03-09. — Т. 19, вып. 1. — С. 93. — ISSN 1471-2105. — doi:10.1186/s12859-018-2092-7.
  33. ↑ Yoav Gilad, Jonathan K. Pritchard, Jonathan E. Burnett, David A. Knowles, Chiaowen Joyce Hsiao. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies (англ.) // Scientific Reports. — 2017-01-03. — Vol. 7. — P. 39921. — ISSN 2045-2322. — doi:10.1038/srep39921.
  34. ↑ Rafael A. Irizarry, Mingxiang Teng, F. William Townes, Stephanie C. Hicks. Missing Data and Technical Variability in Single-Cell RNA- Sequencing Experiments (англ.) // bioRxiv. — 2017-05-08. — P. 025528. — doi:10.1101/025528.
  35. ↑ Luca Pinello, Guo-Cheng Yuan, Jason D. Buenrostro, Andrei Zinovyev, David M. Langenau. Single-cell trajectories reconstruction, exploration and mapping of omics data with STREAM (англ.) // Nature Communications. — 2019-04-23. — Vol. 10, iss. 1. — P. 1903. — ISSN 2041-1723. — doi:10.1038/s41467-019-09670-4.
  36. ↑ Snehalika Lall, Debajyoti Sinha, Sanghamitra Bandyopadhyay, Debarka Sengupta. Structure-Aware Principal Component Analysis for Single-Cell RNA-seq Data // Journal of Computational Biology. — 2018-08-22. — Т. 25, вып. 12. — С. 1365–1373. — doi:10.1089/cmb.2018.0027.
  37. ↑ Philipp Berens, Dmitry Kobak. The art of using t-SNE for single-cell transcriptomics (англ.) // bioRxiv. — 2018-10-25. — P. 453449. — doi:10.1101/453449.
  38. ↑ Serafim Batzoglou, Emma Pierson, Junjie Zhu, Bo Wang. Visualization and analysis of single-cell RNA-seq data by kernel-based similarity learning (англ.) // bioRxiv. — 2016-05-09. — P. 052225. — doi:10.1101/052225.
  39. ↑ Evan W. Newell, Florent Ginhoux, Lai Guan Ng, Immanuel W. H. Kwok, Charles-Antoine Dutertre. Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP (англ.) // Nature Biotechnology. — 2019-01. — Vol. 37, iss. 1. — P. 38–44. — ISSN 1546-1696. — doi:10.1038/nbt.4314.
  40. ↑ Greg Finak, Andrew McDavid, Masanao Yajima, Jingyuan Deng, Vivian Gersuk. MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data // Genome Biology. — 2015-12-10. — Т. 16, вып. 1. — С. 278. — ISSN 1474-760X. — doi:10.1186/s13059-015-0844-5.
  41. ↑ David T. Scadden, Lev Silberstein, Peter V. Kharchenko. Bayesian approach to single-cell differential expression analysis (англ.) // Nature Methods. — 2014-07. — Vol. 11, iss. 7. — P. 740–742. — ISSN 1548-7105. — doi:10.1038/nmeth.2967.
  42. ↑ Benjamin Haibe-Kains, Matthias Dehmer, Frank Emmert-Streib. Gene regulatory networks and their applications: understanding biological and medical problems in terms of networks (англ.) // Frontiers in Cell and Developmental Biology. — 2014. — Т. 2. — ISSN 2296-634X. — doi:10.3389/fcell.2014.00038.
  43. ↑ Susumu Goto, Minoru Kanehisa, Yuki Moriya, Yoshihiro Yamanishi, Masaaki Kotera. GENIES: gene network inference engine based on supervised analysis (англ.) // Nucleic Acids Research. — 2012-07-01. — Vol. 40, iss. W1. — P. W162–W167. — ISSN 0305-1048. — doi:10.1093/nar/gks459.
  44. ↑ Wei Zhang, Seungchan Kim, Edward R. Dougherty, Ilya Shmulevich. Probabilistic Boolean networks: a rule-based uncertainty model for gene regulatory networks (англ.) // Bioinformatics. — 2002-02-01. — Vol. 18, iss. 2. — P. 261–274. — ISSN 1367-4803. — doi:10.1093/bioinformatics/18.2.261.
  45. ↑ Luonan Chen, Zhi-Ping Liu, Jin-Kao Hao, Jingdong Liu, Yongwei Cao. Inferring gene regulatory networks from gene expression data by path consistency algorithm based on conditional mutual information (англ.) // Bioinformatics. — 2012-01-01. — Vol. 28, iss. 1. — P. 98–104. — ISSN 1367-4803. — doi:10.1093/bioinformatics/btr626.
  46. ↑ John C. Marioni, Antonio Scialdone, Jonathan A. Griffiths. Using single‐cell genomics to understand developmental processes and cell fate decisions (англ.) // Molecular Systems Biology. — 2018-04-01. — Vol. 14, iss. 4. — P. e8046. — ISSN 1744-4292 1744-4292, 1744-4292. — doi:10.15252/msb.20178046.
  47. ↑ Yvan Saeys, Helena Todorov, Robrecht Cannoodt, Wouter Saelens. A comparison of single-cell trajectory inference methods (англ.) // Nature Biotechnology. — 2019-05. — Vol. 37, iss. 5. — P. 547–554. — ISSN 1546-1696. — doi:10.1038/s41587-019-0071-9.
  48. ↑ Monika S. Kowalczyk, Itay Tirosh, Dirk Heckl, Tata Nageswara Rao, Atray Dixit. Single-cell RNA-seq reveals changes in cell cycle and differentiation programs upon aging of hematopoietic stem cells (англ.) // Genome Research. — 2015. — Vol. 25, iss. 12. — P. 1860–1872. — doi:10.1101/gr.192237.115.
  49. ↑ Jason C. H. Tsang, Yong Yu, Shannon Burke, Florian Buettner, Cui Wang. Single-cell transcriptomic reconstruction reveals cell cycle and multi-lineage differentiation defects in Bcl11a -deficient hematopoietic stem cells (англ.) // Genome Biology. — 2015. — Т. 16, вып. 1. — С. 178. — doi:10.1186/s13059-015-0739-5.
  50. ↑ Barbara Treutlein, Doug G. Brownfield, Angela R. Wu, Norma F. Neff, Gary L. Mantalas. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq // Nature. — Т. 509, вып. 7500. — С. 371–375. — doi:10.1038/nature13173.
  51. ↑ Jaehoon Shin, Daniel A. Berg, Yunhua Zhu, Joseph Y. Shin, Juan Song. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis // Cell Stem Cell. — 2015. — Т. 17, вып. 3. — С. 360–372. — ISSN 1875-9777. — doi:10.1016/j.stem.2015.07.013.
  52. ↑ Enric Llorens-Bobadilla, Sheng Zhao, Avni Baser, Gonzalo Saiz-Castro, Klara Zwadlo. Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury // Cell Stem Cell. — 2015. — Т. 17, вып. 3. — С. 329–340. — ISSN 1875-9777. — doi:10.1016/j.stem.2015.07.002.
  53. ↑ Qiaolin Deng, Daniel Ramskold, Bjorn Reinius, Rickard Sandberg. Single-Cell RNA-Seq Reveals Dynamic, Random Monoallelic Gene Expression in Mammalian Cells (англ.) // Science. — 2014. — Vol. 343, iss. 6167. — P. 193–196. — doi:10.1126/science.1245316.
  54. ↑ Zhigang Xue, Kevin Huang, Chaochao Cai, Lingbo Cai, Chun-yan Jiang. Genetic programs in human and mouse early embryos revealed by single-cell RNA sequencing // Nature. — 2013. — Т. 500, вып. 7464. — С. 593–597. — ISSN 1476-4687. — doi:10.1038/nature12364.
  55. ↑ Fuchou Tang, Catalin Barbacioru, Siqin Bao, Caroline Lee, Ellen Nordman. Tracing the derivation of embryonic stem cells from the inner cell mass by single-cell RNA-Seq analysis // Cell Stem Cell. — 2010. — Т. 6, вып. 5. — С. 468–478. — ISSN 1875-9777. — doi:10.1016/j.stem.2010.03.015.
  56. ↑ Fuchou Tang, Catalin Barbacioru, Ellen Nordman, Siqin Bao, Caroline Lee. Deterministic and Stochastic Allele Specific Gene Expression in Single Mouse Blastomeres // PLOS ONE. — 2011. — Т. 6, вып. 6. — С. e21208. — ISSN 1932-6203. — doi:10.1371/journal.pone.0021208.
  57. ↑ 1 2 Liying Yan, Mingyu Yang, Hongshan Guo, Lu Yang, Jun Wu. Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells // Nature Structural & Molecular Biology. — 2013. — Т. 20, вып. 9. — С. 1131–1139. — doi:10.1038/nsmb.2660.
  58. ↑ Fan Guo, Liying Yan, Hongshan Guo, Lin Li, Boqiang Hu. The Transcriptome and DNA Methylome Landscapes of Human Primordial Germ Cells // Cell. — 2015. — Т. 161, вып. 6. — С. 1437–1452. — ISSN 1097-4172. — doi:10.1016/j.cell.2015.05.015.
  59. ↑ Fernando H. Biase, Xiaoyi Cao, Sheng Zhong. Cell fate inclination within 2-cell and 4-cell mouse embryos revealed by single-cell RNA sequencing (англ.) // Genome Research. — 2014. — Vol. 24, iss. 11. — P. 1787–1796. — doi:10.1101/gr.177725.114.
  60. ↑ Junchao Shi, Qi Chen, Xin Li, Xiudeng Zheng, Ying Zhang. Dynamic transcriptional symmetry-breaking in pre-implantation mammalian embryo development revealed by single-cell RNA-seq (англ.) // Development. — 2015. — Vol. 142, iss. 20. — P. 3468–3477. — doi:10.1242/dev.123950.
  61. ↑ John I. Murray, Robert H. Waterston, Junhyong Kim, Cole Trapnell, Kai Tan. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution (англ.) // bioRxiv. — 2019-03-01. — P. 565549. — doi:10.1101/565549.
  62. ↑ Diego Adhemar Jaitin, Ephraim Kenigsberg, Hadas Keren-Shaul, Naama Elefant, Franziska Paul. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types // Science (New York, N.Y.). — 2014. — Т. 343, вып. 6172. — С. 776–779. — ISSN 1095-9203. — doi:10.1126/science.1247651.
  63. ↑ В центре внимания раковые стволовые клетки. elementy.ru. Дата обращения: 27 апреля 2017.
  64. ↑ Anoop P. Patel, Itay Tirosh, John J. Trombetta, Alex K. Shalek, Shawn M. Gillespie. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma // Science (New York, N.Y.). — 2014. — Т. 344, вып. 6190. — С. 1396–1401. — ISSN 1095-9203. — doi:10.1126/science.1254257.
  65. ↑ Daniel Ramskold, Shujun Luo, Yu-Chieh Wang, Robin Li, Qiaolin Deng. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells // Nature Biotechnology. — 2012. — Т. 30, вып. 8. — С. 777–782. — ISSN 1546-1696. — doi:10.1038/nbt.2282.
  66. ↑ Nicola Aceto, Aditya Bardia, David T. Miyamoto, Maria C. Donaldson, Ben S. Wittner. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis // Cell. — 2014. — Т. 158, вып. 5. — С. 1110–1122. — ISSN 1097-4172. — doi:10.1016/j.cell.2014.07.013.
  67. ↑ David T. Ting, Ben S. Wittner, Matteo Ligorio, Nicole Vincent Jordan, Ajay M. Shah. Single-cell RNA sequencing identifies extracellular matrix gene expression by pancreatic circulating tumor cells // Cell Reports. — 2014. — Т. 8, вып. 6. — С. 1905–1918. — ISSN 2211-1247. — doi:10.1016/j.celrep.2014.08.029.
  68. ↑ Ayako Suzuki, Koutatsu Matsushima, Hideki Makinoshima, Sumio Sugano, Takashi Kohno. Single-cell analysis of lung adenocarcinoma cell lines reveals diverse expression patterns of individual cells invoked by a molecular target drug treatment (англ.) // Genome Biology. — 2015. — Т. 16, вып. 1. — С. 66. — ISSN 1465-6906. — doi:10.1186/s13059-015-0636-y.
  69. ↑ David T. Miyamoto, Yu Zheng, Ben S. Wittner, Richard J. Lee, Huili Zhu. RNA-Seq of single prostate CTCs implicates noncanonical Wnt signaling in antiandrogen resistance // Science (New York, N.Y.). — 2015. — Т. 349, вып. 6254. — С. 1351–1356. — ISSN 1095-9203. — doi:10.1126/science.aab0917.
  70. ↑ Joshua D. Welch, Yin Hu, Jan F. Prins. Robust detection of alternative splicing in a population of single cells // Nucleic Acids Research. — 2016. — Т. 44, вып. 8. — С. e73. — ISSN 0305-1048. — doi:10.1093/nar/gkv1525.
  71. ↑ Georgi K. Marinov, Brian A. Williams, Ken McCue, Gary P. Schroth, Jason Gertz. From single-cell to cell-pool transcriptomes: Stochasticity in gene expression and RNA splicing // Genome Research. — 2017. — Т. 24, вып. 3. — С. 496–510. — ISSN 1088-9051. — doi:10.1101/gr.161034.113.
  72. ↑ Roi Avraham, Nathan Haseley, Douglas Brown, Cristina Penaranda, Humberto B. Jijon. Pathogen Cell-to-Cell Variability Drives Heterogeneity in Host Immune Responses (англ.) // Cell. — 2015. — Vol. 162, iss. 6. — P. 1309–1321. — ISSN 1097-4172. — doi:10.1016/j.cell.2015.08.027. — PMID 26343579.
  73. ↑ Alex K. Shalek, Rahul Satija, Xian Adiconis, Rona S. Gertner, Jellert T. Gaublomme. Single-cell transcriptomics reveals bimodality in expression and splicing in immune cells (англ.) // Nature. — 2013. — Vol. 498, iss. 7453. — P. 236–240. — ISSN 0028-0836. — doi:10.1038/nature12172.

Литература

Дополнительные ссылки

  • Логотип YouTube Analysis of single cell RNA-seq data (англ.): плей-лист (17 видео) от Bioinformatics Training — University of Cambridge
  • "Введение в scRNA-Seq". CompBiol.ru. Дата обращения: 30 апреля 2017. (недоступная ссылка)
  • "Анализ данных scRNA-Seq: проблемы и методы биоинформатики, часть 1". CompBiol.ru. Дата обращения: 30 апреля 2017. (недоступная ссылка)
  • Логотип YouTube Транскриптомика: практические методы и применяемые алгоритмы А. Предеус, Институт биоинформатики
  • Логотип YouTube Транскриптомика: анализ данных RNA-seq П. Мазин, Факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ
  • RNA-seqlopedia от University of Oregon (англ.). rnaseq.uoregon.edu. Дата обращения: 29 апреля 2017.


Источник — https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=Транскриптомика_одиночных_клеток&oldid=106761838