Кэп-анализ экспрессии генов (CAGE)

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск

Кэп-анализ экспрессии генов (англ. CAGE, cap analysis gene expression) — это технология, используемая в молекулярной биологии, позволяющая с высокой продуктивностью получить последовательности коротких участков 5’-конца мРНК на кэп-сайтах и сайтах старта трансляций (TSP) для эукариот. На основе полученных секвенированных CAGE-последовательностей осуществляется экспрессионный анализ. Использование CAGE-конкатамеров является более доступным способом, чем секвенирование полногеномных библиотек кДНК. Методика была разработана и опубликована в 2003 году.[1]

Обзор эксперимента[править | править вики-текст]

  1. Очистка мРНК от примесей рРНК и тРНК
  2. Синтез кДНК обратной транскриптазой с олиго-Т праймером, комплементарным полиаденилированному 3’-концу мРНК. Получение мРНК-кДНК гибридов.
  3. Гидролиз одноцепочечной мРНК.
  4. Синтез 1-го биотинилированного линкера, содержащего сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции XmaJI и сайт узнавания рестриктазы класса II MmeI. Особенность последней рестриктазы в том, что она делает разрез двухцепочечной нуклеиновой кислоты, отступив 20/18 нуклеотидов.
  5. Лигирование 1-го линкера с одноцепочечной кДНК и синтез второй цепи кДНК.
  6. Обработка эндонулеазой рестрикции MmeI и синтез 2-го биотинилированного линкера, содержащего сайт узнавания XbaI.
  7. Лигирование коротких биотинилированных фрагментов со 2-ым линкером. ПЦР.
  8. Обработка рестриктазами XmaJI и XbaI (получение CAGE-тэгов). Очистка стрептавидином. Получение конкатемеров лигированием липких GATC концов.
  9. Клонирование и секвенирование.
  10. Картирование генома, определения сайтов старта транскрипции и уровней экспрессии.[2]

Анализ[править | править вики-текст]

Результатом кэп анализа экспрессии генов является набор секвенированных областей следующих за сайтами старта транскрипции и уровень экспрессии. Данные области, как правило, включают в себя большую часть элементов, которые регулируют уровень экспрессии генов. Таким образом, различия в частоте встречаемости может коррелировать с наличием либо отсутствием факторов регуляции (транскрипционные факторы, репрессоры и пр.) Благодаря данному методу стало доступным картировать сайты стартов транскрипции и промоторы для мРНК с низким уровнем экспрессии.[3]

Примечания[править | править вики-текст]

  1. "Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of transcriptional starting point and identification of promoter usage". Proc Natl Acad Sci USA. 100(26): 15776–81. 2003-12-23. doi:10.1073/pnas.2136655100. PMC 307644. PMID 14663149.
  2. "CAGE: cap analysis of gene expression". Nature Methods 3, 211 - 222 (2006) doi:10.1038/nmeth0306-211
  3. "Deep cap analysis gene expression (CAGE): genome-wide identification of promoters, quantification of their expression, and network inference". BioTechniques 44:627-632 (25th Anniversary Issue, April 2008) doi 10.2144/000112802

Ссылки[править | править вики-текст]

CAGE — страница на сайте научно-исследовательского центра RIKEN