Полимеразная цепная реакция в реальном времени

В молекулярной биологии, Полимеразная цепная реакция в реальном времени (или количественная ПЦР, кПЦР, ПЦР-РВ, англ. Real-time PCR, qPCR) — лабораторный метод, основанный на методе полимеразной цепной реакции, позволяющий определять не только присутствие целевой нуклеотидной последовательности в образце, но и измерять количество копий матрицы. Количество амплифицированной ДНК измеряется после каждого цикла амплификации с помощью флуоресцентных меток: зондов или интеркаляторов. Такая оценка может быть количественной (измерение непосредственного количества копий матрицы) и относительной (измерение относительно внесённой ДНК или дополнительных калибровочных генов).

Немного модифицированный метод количественного ПЦР называется полуколичественной ПЦР (пкПЦР, англ. semi-quantitative PCR). Он часто используется для сравнения экспрессии нескольких генов. В данном случае измеряют количество накопленного продукта только в одной точке — после остановки реакции.

Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с другими методами: ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией, англ. RT-qPCR), ChIP-кПЦР и др.

Описание метода

Процедура очень похожа на процедуру классической ПЦР, то есть присутствуют все стадии реакции — плавление двухцепочечных ДНК при температуре 95˚C, отжиг праймеров (температура отжига зависит от используемых праймеров) и элонгация при температуре 72˚С, если используется Taq-полимераза. Количество ПЦР-продукта измеряется в каждом цикле ПЦР с помощью флуоресцентных меток. Таким образом, сила сигнала говорит о первоначальном количестве интересующей молекулы.

График амплификации

График амплификации в кПЦР

Номенклатура, обычно используемая для кПЦР:

1. Базовая линия — это циклы ПЦР, в которых флуоресцентный сигнал ниже значения, которое может детектировать прибор.
2. ΔRn — приращение флуоресцентного сигнала в каждый момент времени.
3. Пороговая линия — это произвольный уровень флуоресценции, выбранный на основе базовой линии. Сигнал, который обнаружен выше порога, считается реальным сигналом, который можно использовать для определения порогового цикла (Ct) для образца. Порог можно регулировать для каждого эксперимента, чтобы он находился в области экспоненциального роста на всех графиках.
4. Пороговое число циклов (Ct) — это число циклов ПЦР, при котором флуоресценциия превышает пороговое значение.

График состоит из базовой линии, экспоненциальной фазы и плато.

А — график амплификации. Зависимость уровня флуоресценции от цикла ПЦР для нескольких образцов. В — кривая плавления. На оси ординат производная флуоресценции по температуре со знаком минус, на оси абсцисс — температура. С — кривая плавления. Уровень флуоресценции по времени.

На начальных этапах флуоресценция слабая, так как продукта мало, поэтому её трудно отличить от фона. По мере накопления продукта, сигнал растёт сначала экспоненциально, а затем выходит на плато. Выход на плато объясняется нехваткой того или иного компонента реакции — могут закончиться праймеры, нуклеотидилтрифосфаты, флуоресцентная метка. Если продукта реакции накопилось слишком много, то лимитирующим фактором может стать фермент, и тогда зависимость количества продукта от цикла станет линейной. Стоит отметить, что в стандартной реакции ПЦР в реальном времени все образцы выйдут на плато и достигнут примерно одного уровня сигнала. Таким образом, конечная точка ничего не скажет о начальном количестве исследуемого образца. С другой стороны, в экспоненциальной фазе можно проследить отличия в скорости роста продукта. Различия в начальном количестве молекул влияют на количество циклов, необходимых для поднятия уровня флуоресценции выше уровня шума.

Ct — число, по которому можно судить о количестве целевой ДНК в растворе, но Сt-величина может зависеть от многих случайных факторов, например, чувствительности детектора, качества фильтра и пр. Поэтому точное начальное количество интересующего продукта измерить нельзя. Для решения этой проблемы существуют методы нормировки. Измеряют отношение количеств двух молекул в пробе. Нормируют обычно на продукты генов домашнего хозяйства — генов, количество которых в клетке всегда примерно одинаковое (пример — ген infA, кодирующий фактор инициации трансляции у бактерий). Соотношение определяют по следующей формуле:

$[\mathrm {N} _{0}]_{A}/[\mathrm {N} _{0}]_{B}=(1+\mathrm {E} )^{(\mathrm {Ct} _{B}-\mathrm {Ct} _{A})}$

где $[\mathrm {N} _{0}]_{A}$ и $[\mathrm {N} _{0}]_{B}$ — начальные количества двух образцов, Ct_B и Ct_А — соответствующие Ct-величины, а $\mathrm {E}$ — эффективность ПЦР, которая часто приравнивается к $1$ или $0,9$.

Анализ кривой плавления

ПЦР в реальном времени позволяет идентифицировать конкретные амплифицированные фрагменты ДНК, используя анализ их температуры плавления (денатурации), также называемый величиной Tm. В методе используются интеркалирующие красители, обычно это SYBR Green. Температура плавления ДНК специфична для амплифицированного фрагмента. Результаты этого метода получены путем сравнения кривых диссоциации анализируемых образцов ДНК. Для анализа строится 2 кривые плавления. Первая — это зависимость флуоресценции по времени, вторая — скорость падения флуоресценции по времени. Пик отражает определённый образец ДНК.

Классификация используемых флуорофоров

Неспецифическая детекция: количественная ПЦР с двухцепочечными ДНК-связывающими красителями в качестве репортеров

В данном случае меткой служит химическое соединение, способное интеркалировать в двойную спираль ДНК. Такой зонд меняет свою конформацию при взаимодействии с продуктами ПЦР и становится флуорофором. Детекцию можно проводить в конце каждого цикла, перед стадией денатурации. Примером такой краски может служить широко используемый SYBR Green. Однако красители двухцепочечных ДНК (дцДНК) будут связываться со всеми дцДНК, включая неспецифические продукты ПЦР (такие как димер праймера). Это может потенциально помешать точности мониторинга целевой последовательности.

Специфическая детекция: флуоресцентный репортерный зонд

кПЦР с использованием флуоресцентного зонда

Флуоресцентные репортерные зонды обнаруживают только ДНК-содержащую последовательность, комплементарную зонду; следовательно, использование репортерного зонда значительно повышает специфичность и позволяет повысить точность измерения в присутствии других дцДНК. Однако флуоресцентные репортерные зонды не предотвращают ингибирующий эффект димеров праймера, которые могут подавлять накопление целевых продуктов реакции.

Можно также использовать несколько зондов, у которых флуорофоры имеют разные спектры испускания. В таком случае появляется возможность в одной пробирке детектировать сигнал от разных молекул ДНК. Метод носит название множественной ПЦР (англ. multiplex PCR).

Метод основан на введении комплементарного продукту амплификации ДНК-зонда с флуоресцентным репортером на одном конце зонда и гасителем флуоресценции на противоположном. Когда гаситель находится в непосредственной близости от репортера, он поглощает сигнал и репортер не даёт флуоресценции. Во время амплификации целостность зонда нарушается и репортер можно обнаружить по флуоресценции после возбуждения лазером. Следовательно, увеличение количества продукта, с которым связывается репортерный зонд в каждом цикле ПЦР, вызывает пропорциональное увеличение флуоресценции. Метки могут давать флуоресценцию в фазу элонгации или в фазу отжига ПЦР.

• Метки, работающие в фазу элонгации:

На зонд с 5’ и 3’ концов пришиты флуорофор и его гаситель. Если последовательность зонда не очень длинная, то даже в связанном с ДНК состоянии они будут взаимодействовать друг с другом, и не будет испускаться флуоресценция. Во время элонгации ДНК-полимераза, обладающая 5’-3’-экзонуклеазной активностью (часто используется Taq-полимераза), по одному нуклеотиду диссоциирует зонд от ДНК-мишени. В результате этого процесса и флуорофор, и его гаситель попадут в раствор, где вероятность нахождения этих веществ рядом будет небольшой, и флуоресценция восстановится.

• Метки, работающие в фазу отжига:

1. Флуорогенная шпилька — небольшая одноцепочечная молекула ДНК, которая в свободном состоянии способна образовывать особую пространственную структуру ДНК — шпильку. На один конец цепочки пришивают флуорофор, а на второй — вещество, его гасящее. Последовательность зонда комплементарна ДНК-мишени, которую нужно детектировать. В таком случае те молекулы зонда, которые плавают в растворе, не будут давать флуоресцентный сигнал, а связавшиеся с молекулами ДНК будут претерпевать конформационные изменения, в результате которых произойдет пространственное разнесение флуорофора и его гасителя и восстановление флуоресценции. Детекцию целесообразно проводить после денатурации.
2. Метка, основанная на методе FRET. Основа этого метода — наличие двух зондов, которые связываются с ДНК-мишенью на небольшом расстоянии друг от друга. На 5’-конец одного зонда и 3’-конец второго пришиты флуорофор-донор и флуорофор-акцептор соответственно. При их близком расположении происходит следующее: флуорофор-донор поглощает свет определённой длины волны и испускает свечение в более длинноволновом спектре. Эту волну, в свою очередь, поглощает флуорофор-акцептор и испускает свет, который можно детектировать.

Применение

ПЦР в реальном времени широко используется для решения многих исследовательских задач в лабораториях. Кроме того, этот метод нашёл применение в медицине (для диагностики заболеваний) и в сфере биотехнологий (для определения содержания микроорганизмов в продуктах питания и растительных материалах; для детекции ГМО). Также кПЦР используется для генотипирования вирусов и других патогенов человека и определения их количественного содержания.

Научные исследования

Количественная оценка экспрессии генов

кПЦР используется как один из способов количественных измерений транскрипции генов. Данный метод широко применяется для оценки изменений во времени экспрессии определённого гена, например, в ответ на введение лекарственного средства или изменения условий окружающей среды. Количественная оценка экспрессии генов с помощью традиционных методов обнаружения ДНК ненадежна. Обнаружение мРНК с помощью нозерн-блоттинга, или продуктов ПЦР на геле, или саузерн-блоттинге не позволяет провести точное количественное определение. Например, в течение 20-40 циклов типичной ПЦР количество продукта ДНК достигает плато, которое напрямую не связано с количеством ДНК-мишени в начальной ПЦР.

ПЦР в реальном времени может быть использована для количественной оценки нуклеиновых кислот двумя распространенными методами: относительной количественной оценки и абсолютной количественной оценки. Абсолютное количественное определение дает точное количество целевых молекул ДНК с использованием калибровочной кривой. Поэтому важно, чтобы ПЦР образца и стандарта имели одинаковую эффективность амплификации. Относительная количественная оценка основана на внутренних эталонных генах (генов домашнего хозяйства) для определения кратных различий в экспрессии целевого гена. Количественная оценка выражается как изменение уровней экспрессии мРНК, интерпретируемой как комплементарная ДНК (кДНК, генерируемая обратной транскрипцией мРНК). Относительную количественную оценку легче выполнить, поскольку она не требует калибровочной кривой, поскольку количество изучаемого гена сравнивается с количеством контрольного гена.

кПЦР для определения количества малых ядерных РНК (мяРНК)

мяРНК отличаются по свойствам от мРНК тем, что имеют очень малую длину (около 22 нуклеотидов), не имеют консервативной последовательности на концах, при этом мяРНК одной популяции могут отличаться на один или несколько нуклеотидов. Для решения этих проблем используют подходы, основанные на добавлении небольшого участка ДНК (линкера) к кДНК в реакции обратной транскрипции. Затем проводится ПЦР в реальном времени стандартными способами с использованием праймеров, комплементарных линкеру.

Геномные исследования с применением ChIP-qPCR

Иммунопреципитация хроматина (ChIP) в сочетании с RT-qPCR считается базовым методом в геномных исследованиях, его коммерческая доступность и высокая точность позволяет быстро и легко анализировать взаимодействия белок- ДНК. ChIP-qPCR применяют для исследований конкретных генов и потенциальных регуляторных областей, таких как промоторы. Этот метод в настоящее время используется в разных исследованиях, включая клеточную дифференцировку, молчание генов-супрессоров и влияние модификаций гистонов на экспрессию генов.

Анализ ChIP охватывает только часть возможных мишеней, присутствующих по всему геному из-за вариабельности эффективности сшивания и стерического ограничения доступности антител.

Для проведения ChIP-qPCR необходимо добавить master mix (смесь ферментов и нуклеотидов), праймеры и матричную ДНК. При этом нужно точно подобрать концентрацию праймеров для эффективной амплификации целевой ДНК. В качестве матрицы выступает либо ChIP ДНК, либо в случае отрицательного контроля пустые бусины без ДНК. Затем необходимо подобрать время и температуру циклов отжига, и запустить ПЦР-амплификатор. Результаты анализируют аналогично результатами кПЦР, сравнивая пороговое число циклов (Ct) для матрицы ввода и матрицы ДНК ChIP.

Медицинская диагностика

Количественная ПЦР применяется для быстрого выявления генов или фрагментов ДНК являющихся маркерами инфекционных заболеваний, генетических отклонений и т. д. Внедрение этого метода в клинические лаборатории значительно улучшило качество диагностики инфекционных заболеваний. Кроме того, кПЦР используется в качестве инструмента для детектирования вновь возникающих заболеваний. Например, новых штаммов гриппа.

Использование кПЦР также позволяет проводить количественные измерения и генотипирование (характеристика штаммов) вирусов, например, вируса гепатита B. Степень инфекции, которая оценивается, как число копий вирусного генома на единицу ткани пациента, имеет большое значение во многих случаях. Например, вероятность реактивации вируса простого герпеса типа 1 зависит от количества инфицированных ганглиев.

У пациентов с подозрением на коронавирусную инфекцию забирают мазок из горла, экстрагируют РНК и анализируют методом RT-qPCR. Целевыми генами является открытая рамка считывания 1ab (ORF1ab) и нуклеокапсидный белок (N). Пороговое значение цикла (значение Ct) менее 37 определяют как положительный результат теста, а значение Ct 40 или более как отрицательный результат теста. Данные диагностические критерии основаны на рекомендации Национального института контроля и профилактики вирусных заболеваний.

Чувствительность RT-qPCR теста составляет 83,3 %, данный тест склонен к ложноотрицательным результатам. Для диагностики коронавируса также используют компьютерную томографию, чувствительность которой значительно выше и составляет 97,2 %.

Количественная ПЦР также широко используется для детекции опухолевых клеток в материале из со́лидных опухолей и даже при некоторых формах лейкемии.

кПЦР помогает выявлению циркулирующих опухолевых клеток. Так, например, рак молочной железы все ещё является наиболее частой причиной смерти среди раковых больных. Причём, часто смерть вызвана не только самой опухолью, но и возникшими метастазами. Сами метастазы возникают в результате того, что особенные клетки, способные к пролиферации, отделяются от опухоли, выходят в кровяное русло и вторично поселяются в какой-то части организма. Эти клетки называются циркулирующими стволовыми клетками (ЦСТ). Присутствие таких клеток в крови пациентов, больных раком молочной железы, как правило, связано с плохим прогнозом исхода терапии и выживаемости в целом, поэтому является очень важным диагностическим параметром. Но из-за очень низкого количества, выявление ЦСТ — является довольно трудной задачей. И кПЦР, как высокочувствительный метод, может быть использован для решения этой проблемы. Дело в том, что, как и все раковые клетки, ЦСТ имеют эпителиальное происхождение и, следовательно экспрессируют определённый набор генов, отличающийся от окружающих их клеток крови, имеющих мезенхимальное происхождение. Для применения этого метода необходимо определить набор генов-маркеров ЦСТ и оценить их уровень экспрессии.

В микробиологии

ПЦР в реальном времени также применяется для микробиологических работ в сфере безопасности продуктов питания, для оценки качества вод (питьевых и сточных) и в сфере здравоохранения. Кроме того, данный метод используется для идентификации кишечной микрофлоры

Обнаружение фитопатогенов

Агропромышленность стремится производить семена и рассаду, не содержащую патогенных микроорганизмов, с целью предотвращения экономических потерь и увеличения срока хранения. Поэтому были разработаны системы, позволяющие обнаружить небольшие количества ДНК фитофторы (Phytophthora ramorum), оомицетов и некоторых других патогенов, которые приводят к гибели дубов и других видов растений, в смеси с ДНК растения-хозяина. Возможность различить ДНК возбудителя и растения-хозяина основана на амплификации последовательностей ITS (internal transcribed spacer), внутренних транскрибируемых участков, расположенных в кодирующей области гена рибосомной РНК, которые характерны для каждого таксона.

Детекция генетически модифицированных организмов

кПЦР (с использованием обратной транскрипции) может быть использована для детекции ГМО (генетически модифицированных организмов), так как является более чувствительным по сравнению со многими другими методами. При этом специфические праймеры используются для амплификации промотора, терминатора или даже промежуточных последовательностей, используемых в процессе создания вектора. Так как процесс создания трансгенного растения обычно приводит к вставке более, чем одной копии трансгена, его количество также обычно оценивается с помощью кПЦР. При этом в качестве контроля используют растение, содержащее данный ген в единственном экземпляре.

См. также

• Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
• ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

Литература

• Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. — Москва: Мир, 2002. — 589 с. — ISBN 5030033289.