Индуцированные стволовые клетки

Файл:Dedifferentiation Methods (2010) - Bischoff, Steven R.tif

Онтогенез начинается от одной клетки - зиготы. Зигота и каждый из бластомеров эмбриона на ранней стадии являются тотипотентными с потенциалом развития в целый организм. По мере развития потенциал бластомеров последовательно снижается сначала до плюрипотентных, затем до мультипотентных и унипотентных и, в конце концов, до терминально дифференцированных соматических клеток. Тем не менее, потенциал развития соматических клеток может быть восстановлен до тотипотентной стадии методом пересадка ядер, взятых из соматических клеток, в яйцеклетку, из которой предварительно удалено ядро (SCNT) или перепрограммированием до плюрипотентного состояния – например, с помощью факторов Яманаки (Oct4, Klf4, Sox2 и c-Myc) , РНК или малых молекул .

Индуцированные стволовые клетки (иСК) — cтволовые клетки, полученные из каких-либо иных (cоматических, репродуктивных или плюрипотентных) клеток путем эпигенетического перепрограммирования. В зависимости от степени дедифференцировки клетки при перепрограммировании различают: индуцированные тотипотентные, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) и получаемые так называемым прямым перепрограммированием или каким-либо иным способом индуцированные прогениторные (мультипотентные или унипотентные) стволовые клетки, иногда называемые также индуцированными соматическими стволовыми клетками (ИССК).

В настоящее время существует три пути перепрограммирования соматических клеток в плюрипотентные стволовые клетки:

1. пересадка ядер, взятых из соматических клеток, в оплодотворенную яйцеклетку, из которой предварительно удалено ядро
2. слияние соматических клеток с плюрипотентными стволовыми клетками;
3. модификация соматической клетки, индуцирующая её превращение в стволовую клетку, с помощью: генетического материала кодирующего белковые репрограммирующие факторы; рекомбинантных белков; микроРНК, синтетической самореплицирующейся полицистронной РНК и низкомолекулярных биологически активных веществ.

Природные процессы индукции

Метаплазией называют обратимую замену одного дифференцированного типа клеток на другой тип зрелых дифференцированных клеток. Этот переход от одного типа клеток к другому может быть частью нормального процесса созревания или вызван каким-то индуцирующим его стимулом. Примерами этого перехода можно назвать трансформацию клеток радужной оболочки глаза в линзу в процессе созревания и превращение клеток пигментного эпителия сетчатки в нейральную сетчатку при регенерации глаза у взрослых тритонов. Этот процесс позволяет организму заменить исходные клетки, не подходящие к новым условиям, на новые которые больше подходят к новым условиям. В опытах на клетках имагинальных дисков дрозофилы было обнаружено, что существует ограниченное число стандартных дискретных состояний дифференцировки и клеткам приходится выбирать одно из них. Тот факт, что трансдетерминация (смена пути дифференцировки) часто происходит не в одной, а сразу в группе клеток доказывает, что она вызвана не мутацией, а именно индуцирована.

Индуцированные тотипотентные клетки

Индуцированные тотипотентные клетки обычно используют для клонирования и получения генетически модифицированных животных. Эти клетки можно получить с помощью перепрограммирования соматических клеток путём переноса ядер соматических клеток (Somatic cell nuclear transfer — SCNT) в ооциты-реципиенты. При этом ооциты не обязательно должны принадлежать тому же виду. Иногда удается использовать ооциты других видов, например овец. Эффективность перепрограммирования можно повысить в два раза, если за сутки до пересадки остановить мейоз ооцитов-реципиентов с помощью бутиролактона1 в комбинации с нейротрофическим фактором мозга (BDNF). Разработан метод, открывающий новые возможности для создания генетически модифицированных животных с помощью гаплоидных эмбриональных стволовых клеток, которые могут быть использованы вместо спермы. Для этого из ооцита удаляют ядро. Затем в него вводят микроинъекцией сперму. Из образующейся в результате этого бластоцисты получают гаплоидные эмбриональные стволовые клетки. Эти клетки, синхронизованные в М фазе, вводят в ооцит вместо спермы, в результате чего развивается жизнеспособное потомство. Эти разработки, вместе с данными о возможности неограниченного получения ооцитов из митотически активных половых стволовых клеток, открывают возможность промышленного производства трансгенных сельскохозяйственных животных. Так, в Китае с помощью упрощенной техники клонирования получены трансгенные овцы, у которых улучшено качество мяса и молока за счет увеличения в них незаменимых ненасыщенных жирных кислот, которые снижают риск развития ишемической болезни сердца и необходимы для поддержки глаз и головного мозга. Ген, вызывающий синтез ω-3 полиненасыщенных жирных кислот успешно удалось передать трансгенной овце.

Повторное клонирование на протяжении 25 поколений жизнеспособных мышей с помощью метода SCNT, основанном на добавлении в среду клеточной культуры ингибитора деацетилазы гистонов — трихостатина А, показало, что можно достаточно долго (на протяжении 16 лет) неоднократно повторно клонировать животных без видимого накопления нарушений в геноме.

Подобные технологии могут также найти клиническое применения для преодоления цитоплазматических дефектов в ооцитах человека. Например, разработаны технологии, которые могут воспрепятствовать нежелательному наследованию митохондриального заболевания, которое передается следующему поколению. Митохондрии, которые часто называют «электростанцией клетки», содержат генетический материал, который передается от матери к ребёнку. Мутации митохондриальной ДНК могут вызвать диабет, глухоту, заболевания глаз, желудочно-кишечные расстройства, болезни сердца, деменцию и ряд других неврологических заболеваний. Пересадкой ядра из яйцеклетки одного человека (несущей дефектную митохондриальную ДНК) в другую (здоровую) можно эффективно заменить цитоплазму клетки и вместе с ней митохондрии (и их ДНК). Полученная таким образом яйцеклетка может рассматриваться как имеющая двух матерей. Эмбрион образующийся после оплодотворения такой яйцеклетки будет иметь здоровую митохондриальную ДНК. Однако насколько оправданы подобные манипуляции с клетками человека с точки зрения биоэтики пока не ясно.

ИПСК как результат радикального омоложения

Файл:Трансплантация клеток тератокарциномы.JPG

Если поместить клетки тератокарциномы в ранний зародыш млекопитающего (на стадии бластоцисты), то они включаются в состав клеточной массы бластоцисты и из такого химерного (то есть состоящего из клеток от разных организмов) эмбриона нередко развивается нормальное химерное животное. Почти во всех органах и тканях таких животных часть дифференцированных клеток происходит из клеток тератокарциномы, которые совместно с клетками нормального происхождения участвуют в построении здорового организма. Аналогичная трансплантация клеток тератокарциномы во взрослый организм неизменно приводит к развитию тератокарциномы.

Впервые ИПСК были получены в виде перевиваемой тератокарциномы индуцированной трансплантатом, взятым из мышиных эмбрионов. Было доказано, что тератокарциномы образуются из соматических клеток. Тот факт, что из клеток тератокарциномы можно получить нормальную мышь доказывал их плюрипотентность. Оказалось, что клетки тератокарциномы, выделяя в культуральную среду различные факторы, способны поддерживать культуру плюрипотентных стволовых клеток эмбриона в недифференцированном состоянии. Таким образом, ещё в 1980-е годы стало ясно, что трансплантация плюрипотентных или эмбриональных стволовых клеток во взрослый организм млекопитающих обычно приводит к образованию тератомы, которая затем может превратиться в злокачественную опухоль — тератокарциному. Если, однако, поместить клетки тератокарциномы в ранний зародыш млекопитающего (на стадии бластоцисты), то они включаются в состав клеточной массы бластоцисты и из такого химерного (то есть состоящего из клеток от разных организмов) эмбриона нередко развивается нормальное химерное животное. Почти во всех органах и тканях которого часть дифференцированных клеток происходит из клеток тератокарциномы, которые совместно с клетками нормального происхождения участвуют в построении здорового организма. Это свидетельствовало о том, что причиной образования тератомы является диссонанс в стадии развития донорных клеток и окружающих их клеток реципиента (так называемой ниши). Уже тогда, используя ретровирусные векторы, удалось ввести инородные гены в мышиные химеры, полученные с помощью клеток тератокарциномы.

Файл:Система отбора факторов плюрипотентности.JPG

Японские исследователи Такахаши и Яманака разработали систему отбора факторов плюрипотентности, использующую фибробласты, содержащие кассету устойчивости к антибиотику неомицину с промотором гена Fbx15, который активен в раннем эмбрионе, но не экспрессируется в фибробластах Для индукции перепрограммирования, авторы заражали тестирующие фибробласты ретровирусными векторами, каждый из которых нес уникальную кольцевую ДНК, кодирующую ген молекулы кандидата в факторы перепрограммирования. Если ядерное перепрограммирование произошло, то эти фибробласты должны синтезировать β-галактозидазу и стать устойчивыми к высоким концентрациям неомицина

В августе 2006 года японские исследователи сумели превратить клетки мышиной кожи (фибробласты) в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки — ИПСК (induced pluripotent stem cells — iPSC), используя для модификации клетки всего четыре репрограммирующих фактора: Oct4, Klf4, Sox2 и c-Myc, доставленных в ядро ретровирусами . Этим они доказали, что гиперэкспрессия небольшого количества факторов иногда может подтолкнуть клетки к переходу в новое стабильное состояние, связанному с изменениями активности тысяч генов. По своим свойствам ИПСК оказались очень похожи на эмбриональные стволовые клетки (ЭСК). Так, сравнение протеома и фосфопротеома ЭСК и ИПСК, проведенное на 4-х линиях человеческих эмбриональных стволовых клеток и 4-х линиях индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, показало, что большинство идентифицированных белков и участков фосфорилирования в белках всех линий совпадают. Хотя были и небольшие, но статистически воспроизводимые различия, свидетельствующие об определенном функциональном различии. Не было отмечено и особых изменений в последовательности ДНК, особенно если ИПСК были получены с помощью неинтегрирующихся в геном плазмид. Позднее, с развитием технологии перепрограммирования, лучшим доказательством идентичности ИПСК и ЭСК стала возможность получения взрослой мыши полностью из некоторых линий ИПСК . Важным преимуществом ИПСК перед ЭСК является то, что они могут быть получены из клеток взрослого организма, а не из эмбриона. Поэтому стало возможным получать ИПСК от взрослых и даже пожилых пациентов. Перепрограммирование соматических клеток в ИПСК приводит к их омоложению о чём свидетельствуют данные исследования теломеров— концевых участков хромосом состоящих из коротких следующих друг за другом повторов эволюционно консервативной последовательности ДНК. Выяснилось, что перепрограммирование приводит к удлинению теломеров и их нормальному укорочению по мере дифференцировки ИПСК обратно в фибробласты. Таким образом, при индуцированной плюрипотенции восстанавливается эмбриональная длина теломеров, а значит, увеличивается потенциальное число делений клетки, ограниченное так называемым лимитом Хайфлика (Hayflick limit). Поэтому технологию получения ИПСК следует рассматривать как способ радикального омоложения. Из-за диссонанса в стадии развития омоложенных клеток и окружающих их старых клеток реципиента, инъекция пациенту его же собственных ИПСК, обычно приводит к иммунной реакции, что может быть использовано в медицинских целях, или образованию опухолей типа тератомы. Одной из причин иммуногенности аутологичных ИПСК и ЭСК считается группа из 9 генов (Hormad1, Zg16, Cyp3a11, Lce1f, Spt1, Lce3a,Chi3L4, Olr1, Retn), синтез которых повышен в тератомах, полученных из этих клеток Очевидно, некоторые клетки, дифференцированные из ИПСК и ЭСК, продолжают синтезировать эмбриональные изоформы белков и неадекватно интерпретируют сигналы окружающих их клеток реципиента. В связи c этим следует отметить, что образование тератомы из плюрипотентных стволовых клеток может быть вызвано низкой активностью фермента PTEN, способствующей выживанию, в процессе дифференцировки, небольшой популяции (не превышающей 0,1-5 % от общей численности клеток) высоко онкогенных клеток карциномы, инициирующих тератомы. Выживание этих инициирующих тератомы клеток связано с недостаточной репрессией Nanog, а также с повышением метаболизма глюкозы и холестерина. Эти, инициирующие образование тератом, клетки характеризуются также более низким соотношением p53/p21 по сравнению с неонкогенными клетками.

Недавно методом отбора удалось найти небольшие молекулы (цитотоксические селективные ингибиторы плюрипотентных стволовых клеток человека), которые предотвращают образование тератомы у мышей после трансплантации им плюрипотентных стволовых клеток человека. Самое мощное и селективное из этих соединений — PluriSIn #1, вызывало ингибирование стеароил-КоА десатуразы (ключевого фермента в биосинтезе олеиновой кислоты), что в конечном итоге приводило к апоптозу плюрипотентных стволовых клеток. С помощью этой молекулы удается выборочно удалить из культуры недифференцированные клетки.. Эффективной стратегией избирательного устранения плюрипотентных клеток, которые способны дать начало тератоме является ингибирование характерных для этих клеток антиапоптотических факторов, таких как сурвивин (en:survivin) или Bcl10. Обработкой малыми молекулами, которые могут ингибировать эти антиапоптотические факторы, можно добиться селективного удаления подобных клеток вызвав их апоптоз. В частности, одной обработки смешанной популяции химическими ингибиторами сурвивина (такими как, например, кверцетин или YM155) достаточно чтобы вызвать избирательную и полную гибель недифференцированных клеток, вызванную накоплением р53 в митохондриах. Этого, по мнению авторов исследования, достаточно, чтобы предотвратить образование тератомы после трансплантации клеток полученных из ИПСК. Тем не менее, маловероятно, что какая либо, пусть даже самая изощренная, предварительная очистка, способна обезопасить подсадку ИПСК или ЭСК, так как при избирательном удалении плюрипотентных клеток, они вновь довольно быстро возникают путем превращения дифференцированных клеток обратно в стволовые (к обратному переходу может в частности подтолкнуть гипоксия ), что приводит к образованию опухоли. Это может быть связано с нарушением регуляции осуществляемой микро РНК let-7 по отношению к ее мишени — белку Nr6a1 (известному также как ядерный фактор зародышевых клеток — GCNF), являющемуся эмбриональным репрессором транскрипции генов плюрипотентности, который необходим для правильной дифференциации индуцированных плюрипотентных клеток. Поэтому использование ИПСК для клеточной терапии пока ограничено. Тем не менее, они могут быть использованы для целого ряда иных целей — включая моделирование болезней, скрининг (селективный отбор) лекарств, проверку токсичности различных препаратов.

Интересно отметить, что ткани, выращенные из ИПСК, помещенных в «химерные» эмбрионы на ранних стадиях развития мыши, практически не вызывают иммунного ответа (после того, как эмбрионы выросли во взрослых мышей) и пригодны для аутологичной трансплантации, причем даже в том случае когда ИПСК получены от очень старых животных. В то же время, полное перепрограммирование взрослых клеток в тканях у мышей in vivo путем временной активации факторов Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус, приводит к образованию в различных органах множества тератом . Смотри рисунок [1]

Эффективность перепрограммирования в ИПСК

До настоящего времени недостаточно понятно, почему эффективность перепрограммирования с помощью факторов транскрипции значительно ниже, чем при пересадке ядра в ооцит. Показано, что большинство фибробластов кожи взрослого человека начинают процесс перепрограммирования сразу после обработки трансгенами Яманаки (Oct4, Sox2, Klf4, и c-Myc). Тем не менее, только небольшая часть (~ 1%) из этих «новоиспеченных» ИПСК образуют впоследствии колонии ИПСК . Причиной, понижающего эффективность перепрограммирования, возврата большинства клеток к состоянию дифференцировки может быть:

• недостаточная деятельность активируемой цитидиндезаминазы (AID) из-за чего клетки не могут стабилизироваться и долго поддерживать состояние плюрипотенции .
• недостаточная активность гена SMC1 кодирующего один из белков когезина (необходимого для образования внутрихромосомной петли сближающей промоутер гена с последующим энхансером, что необходимо для активации эндогенных генов плюрипотентности), делает невозможным достижение плюрипотентности
• важную роль на поздних этапах перепрограммирования играют и ферментативные модификации гистонов. Показано, что необходимым условием эффективного перепрограммирования является подавление белкового комплекса ремоделирования нуклеосом и деацетилирования (nucleosome remodeling and deacetylation – NuRD). Избыточная экспрессия субъединицы NuRD, называемой Mbd3, ингибирует индукцию ИПСК. Причиной этого является деацетилирование комплексом NuRD лизина 27 в молекуле гистона Н3К27ac, что позволяет Поликомб Репрессорному комплексу 2 (PRC2) осуществить триметилирование лизина 27 в гистоне H3, приводящее, в конечном счете, к ингибированию ряда генов-маркеров , в том числе генов Oct4 и Nanog. Ингибирование Mbd3, с другой стороны, повышает эффективность перепрограммирования и способствует образованию плюрипотентных стволовых клеток, которые способны генерировать жизнеспособных химерных мышей, даже в случае отсутствия с-Мус или Sox2 . Очевидно, Mbd3/NuRD исполняет роль эпигенетического регулятора, который ограничивает экспрессию ключевых генов плюрипотентности. Поэтому подавление Mbd3/NuRD (например, с помощью бутирата, вальпроевой кислоты, субероиланилидгидроксамовой кислоты или трихостатина А) может стать мощным средством для повышения эффективности и точности перепрограммирования. Действительно, подавив Mbd3 удалось впервые осуществить детерминированное и синхронизированное перепрограммирование клеток кожи мыши и человека в ИПСК в течение всего семи дней и с невиданной ранее эффективностью - около 100%

Дифференцировка ИПСК в условиях in vivo в тератоме

Тот факт, что ИПСК человека способны к образованию тератом не только в теле человека, но и в организме некоторых животных, в частности в организме мыши или свиньи, позволил разработать метод дифференцировки ИПСК в условиях in vivo. Для этого ИПСК вводят, вместе с клетками индуцирующими направленную дифференцировку, генмодифицированной свинье или мыши, у которой подавлена активация иммунной системы на клетки человека, а затем, вырезав образовавшуюся тератому, выделяют из нее необходимые дифференцированные клетки человека, используя моноклональные антитела к тканеспецифичным маркерам на поверхности полученных клеток. Этот метод был успешно использован для получения функциональных миелоидных, лимфоидных и эритроидных клеток человека пригодных для трансплантации (пока только мышам). Таким образом, доказана возможность производства in vivo из клеток пациента необходимых ему дифференцированных клеток для трансплантации, изготовления антител или скрининга лекарственных средств. Используя MitoBloCK-6 и /или PluriSIn #1 можно очистить полученные прогениторные клетки от плюрипотентных клеток образующих тератому. Тот факт, что дифференцировка проходит в условиях тератомы позволяет надеяться, что полученные клетки достаточно устойчивы к стимулам способным запустить их обратный переход к дедифференцированному (плюрипотентному) состоянию, а значит безопасны. Беспокойство, однако, вызывает тот факт, что «воспитанные» в тератоме у животных человеческие клетки за время своего «воспитания», по всей вероятности, поглощают значительное количество экзосом произведенных окружающими клетками организма носителя тератомы, а значит, попав в организм человека, могут повести себя неадекватно.

Получение репродуктивных клеток из ИПСК

Используя среды, содержащие ретиноевую кислоту и фолликулярную жидкость свиньи, можно получить in vitro, дифференцировкой из ИПСК, клетки ранних стадий гаметогенеза подобные репродуктивным клеткам, из которых образуются сперма и ооциты

Получение клеток хрусталика и сетчатки глаза из ИПСК

В ближайшее время предполагается приступить к клиническим испытаниям, призванным продемонстрировать безопасность использования ИПСК для клеточной терапии людей с катарактой а также с возрастной дегенерацией желтого пятна — заболевания, которое повреждая сетчатку, может привести к слепоте. Описаны методы получения из ИПСК клеток хрусталика и сетчатки и способы их использования для клеточной терапии, которая по крайней мере на 6 недель улучшала зрение у подопытных животных.

Получение клеток печени из ИПСК

Гепатоциты человека имеют очень ограниченную способность к восстановлению после повреждений печени. Поэтому трансплантация печени нередко является единственным способом лечения таких болезней как цирроз. Клеточная терапия печени затрудняется тем, что культура гепатоцитов плохо размножается in vitro. Поэтому удобнее размножить клетки в виде ИПСК, и только затем превратить их в гепатоциты. Разработано несколько способов получения гепатоцитов из ИПСК

Обнаруженная у совместной культуры гепатоцитов, полученных из ИПСК, с эндотелиальными (для образования сосудов) и мезенхимальными (для образования поддерживающего внеклеточного матрикса) клетками, способность к самоорганизации (самосборке) в трехмерные шарообразные структуры, представляющие собой зачаток печени позволяет надеяться, что в будущем трансплантологам: не надо будет искать и ждать донора, больному будут пересаживать зачаток нужного органа, полученный из его же собственных клеток, и этот зачаток будет уже на месте дорастать до нужных размеров.

Получение нервных стволовых клеток человека из ИПСК

Юань и коллеги сообщили, что нервные стволовые клетки человека, индуцированные из ИПСК с помощью ретиноевой кислоты в бессывороточной среде имеют стабильный нейронный фенотип. После трансплантации крысам со смоделированным ишемическим инсультом, эти клетки не только выжили, но и мигрировали в зону ишемии мозга, где дифференцировались в зрелые нервные клетки, что оказало благотворное влияние на функциональное восстановление утраченных от повреждения в результате инсульта неврологических функций

Индуцированные прогениторные стволовые клетки

Методы прямой трансдифференцировки

В связи с тем, что использование ИПСК для клеточной терапии сопряжено с большим риском опухолей и рака необходима разработка методов получения более безопасных клеточных линий пригодных для применения в клинике. Альтернативой методам ИПСК стала техника так называемого «прямого перепрограммирования» то есть индуцируемой определенными факторами прямой трансдифференцировки, без предварительного прохождения клеток через стадии плюрипотентного состояния. Основу для такого подхода заложили исследования Тейлор и Джонса (Taylor and Jones), показавших, что воздействие 5-азацитидина — реактива вызывающего деметилирование ДНК — на бессмертную линию клеток мышиных эмбриональных фибробластов способно, вызвать образование миогенных, хондрогенных и адипогенных клонов и Вейнтрауба с соавторами, обнаруживших, что для перепрограммирования достаточно активации всего одного гена, позднее названного MyoD1. По сравнению с ИПСК, для перепрограммирования которых требуются не менее двух недель, образование индуцированных прогениторных клеток происходит сравнительно быстро — иногда за несколько дней. Эффективность перепрограммирования также обычно во много раз выше. Для этого перепрограммирования не всегда требуется деление клетки. Но главное, это то, что получаемые в результате перепрограммирования мультипотентные соматические стволовые клетки более пригодны для клеточной терапии так как не образуют тератомы.

Перепрограммирование путем поэтапного моделирования процессов регенерации

Ещё один способ перепрограммирования заключается в поэтапном моделировании на скелетной мышце млекопитающих процессов, которые происходят у амфибий при регенерации конечности. Таким образом, с помощью химических веществ: миосеверина (myoseverin), реверсина ((2-(4-морфолиноанилино)-6-циклогексиламинопурина) и некоторых других веществ, в условиях культуры мышечных клеток млекопитающих, которые, как известно, не способны регенерировать конечности, удалось индуцировать процессы аналогичные тем которые протекают при регенерации конечностей у амфибий и получить предшественники мышечных, костных, жировых и нервных клеток.

Трансдифференцировка с помощью антител

Обнаружены моноклональные антитела, способные преобразовывать стволовые клетки костного мозга непосредственно в прогениторные клетки нейронов головного мозга.

Для этой трансдифференцировки как оказалось достаточно всего одного белка — антитела имитирующего фактор GCSF. Для поиска подобных антител используется специальный метод селекции антител

Условно перепрограммированные клетки (УПК)

Ричард Шлегель и его исследовательская группа разработали метод, который позволяет размножать in vitro культуру клеток похожих на взрослые стволовые клетки, без каких-либо генетических манипуляций. Они показали, что под воздействием облученных фибробластов (см. обзоры и) и ингибитора Rho киназы — Y-27632, первичные эпителиальные клетки млекопитающих переходят к состоянию неограниченной пролиферации (что, по мнению авторов, связано с ростом концентрации β-катенина в ядре и снижением Notch сигнализации). Индукция УПК происходит довольно быстро (в течение 2 дней) и является результатом «перепрограммирования» всей клеточной популяции, а не одной из ее субпопуляций. При этом в УПК не наблюдалась характерная для ИПСК или эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) активация синтеза Sox2, Oct4, Nanog, и Klf4. Эта индукция УПК обратима — достаточно удалить Y-27632 и облученные фибробласты, чтобы клетки перешли к обычной дифференцировке. Этот метод может иметь большое будущее в регенеративной медицине, так как эти клетки в отличие от ИПСК не образуют опухоли. Так, например, используя технологию условно-перепрограммированных клеток, исследователи смогли найти эффективную терапию для пациента с редким типом опухоли легких.

Косвенное перепрограммирование клеток (ILC)

Разработан метод при котором соматические клетки переходят в промежуточное пластическое состояние- частично перепрограммированные ИПСК (pre-iPSC), индуцированное кратковременным воздействием перепрограммирующих факторов, а затем дифференцируются с помощью специально разработанной химической среды (искусственной ниши). Предполагается, что этот новый метод может быть более эффективным и безопасным, так как он, по мнению его авторов, не вызывает опухоли или другие нежелательные генетические изменения, и при этом позволяет получать требуемые клетки быстрее и c гораздо большим выходом по сравнению с другими методами. Тем не менее, безопасность этих клеток все же сомнительна — учитывая то, что преобразование из пре-ИПСК опирается на использование условий перепрограммирования в ИПСК, и нельзя исключить что часть клеток может все же приобрести плюрипотентные свойства(если они не прекратят процесса де-дифференциации in vitro или в связи с дальнейшей де-дифференцировкой in vivo).

Иной подход к получению косвенно перепрограммированных клеток заключается в ингибировании мембранного белка CD47, являющегося рецептором тромбоспондина-1. Показано, что потеря CD47 снимает запрет на устойчивую пролиферацию первичных мышиных эндотелиальных клеток, повышая частоту их асимметричного деления, а также позволяет этим клеткам спонтанно перепрограммироваться в мультипотентные клетки формирующие эмбриональные тела. Нокдаун гена CD47 резко увеличивает в клетках уровни мРНК с-Мус и других факторов перепрограммирования Яманаки как in vitro, так и in vivo. Очевидно, тромбоспондин-1 является ключевым сигналом нишы, который подавляет способность стволовых клеток к самообновлению влияя на них через CD47. Поэтому антагонисты CD47 могут активировать самообновление и перепрограммирование клеток выключая механизмы негативной регуляции с-Мус и других факторов транскрипции стволовых клеток По мнению авторов исследования, образующиеся при этом мультипотентные клетки не образуют тератом.

Перепрограммирование воздействием на гликопротеин наружней мембраны

Общей особенностью, взятых из разных источников, плюрипотентных стволовых клеток, отличающей их от большинства (исключение составляют лейкоциты) неплюрипотентных клеток, является особый характер гликозилирования белков их наружней мембраны. Очевидно, изменения характера гликозилирования белков наружней мембраны являются маркерами состояния клетки каким-то образом связанными с плюрипотенцией и дифференцировкой. Причем «сдвиг» в характере гликозилирования, по всей видимости, это не, просто результат инициализации экспрессии генов, а механизм играющий роль важного регулятора группы генов, вовлеченных в приобретении и поддержании недифференцированного состояния. Так, показано, что активация гликопротеина ACA , связывающего гликозилфосфатидилинозитол на поверхности прогениторных клеток периферической крови человека, посредством сигнального каскада PI3K/Akt/mTor/PTEN индуцирует повышение экспрессии генов Wnt, Notch1, Bmi–1 и HoxB4, а также способствует образованию и самообновлению популяции гемопоэтических стволовых клеток . Более того показано, что индуцируемая посредством ACA–зависимого сигнального пути дедифференцировка прогениторных клеток, приводит к образованию ACA–индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, способных дифференцироваться in vitro в клетки всех трех зародышевых листков. . Изучение избирательно связывающих гликопротеины лектинов, на предмет их способности поддерживать культуру плюрипотентных стволовых клеток человека, привело к открытию лектина эритрина кристагалли (Erythrina Cristagalli - ЕСА) способного служить в качестве простой и высокоэффективной матрицы для культивации человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Перепрограммирование индуцированное физическим воздействием

Согласно Гуаньнань Су с соавт., формирование в культуре клеток 3D сфер, в связи с вынужденным ростом клеток на поверхности с низкой связывающей способностью, иногда приводит к перепрограммированию клеток. В качестве примера они показали, что нервные клетки-предшественники могут быть получены непосредственно из фибробластов путем физического воздействия, без введения экзогенных перепрограммирующих факторов. Ранее подобные сферы были получены в опытах с фибробластами мыши с мутацией инактивирующей ген-супрессор опухолей ретинобластомы - RB1 , Белка без которого клетки теряют способность к старым контактам и контактному ингибированию пролиферации в результате чего выходят за пределы колонии и образуют сферы где доминируют новые межклеточные контакты, по всей видимости, и вызывающие самопроизвольное перепрограммирование в тератомоподобные стволовые клетки .

Индуцированные нервные стволовые клетки (иНСК)

Центральная нервная система млекопитающих имеет крайне ограниченные возможности для регенерации. Поэтому для лечения многих нервных расстройств (таких как: инсульт, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз и т. д.) требуются нервные стволовые клетки, автологичным источником которых могут стать иНСК пациента. В ряде новейших публикаций описано прямое преобразование соматических клеток в индуцированные нервные стволовые клетки.

По некоторым данным, в принципе, возможно, преобразовать трансплантированные в мозг мыши фибробласты и астроциты человека, спроектированные методами генной инженерии на выработку факторов (Ascl11, Brn2a и Myt1l) индуцирующих их перепрограммирование в нейроны, активируя после трансплантации соответствующие гены с помощью активатора добавленного к питьевой воде животных. Было также показано, что in situ эндогенные астроциты мыши могут быть напрямую преобразованы в нейроны.. Важно отметить, что в отличие от ИПСК, полученные таким образом клетки не пролиферируют, а значит более безопасны.

Как показано в обзоре Бельмонто с соавт. способы прямого преобразования соматических клеток в индуцированные нервные стволовые клетки отличаются по своим методическим подходам. Какой из этих подходов окажется наиболее приемлемым для клиники покажут исследования.

Прогениторные клетки олигодендроцитов (ПКОД)

Без миелиновой оболочки, выполняющей роль изоляции волокон нейронной сети, сигналы посланные по нервам быстро затухают. Поэтому при заболеваниях, связанных с потерей миелиновой оболочки, таких как рассеянный склероз, наблюдается снижение интеллекта, парез, атаксия туловища и конечностей, нарушения зрения, потеря чувствительности и ряд других неврологических симптомов. Перспективным подходом к лечению подобных заболеваний является трансплантация клеток-предшественников олигодендроцитов (ПКОД), способных заново создать миелиновую оболочку вокруг пораженных нервных клеток. Для такой терапии необходимо иметь доступный источник этих клеток. Основу для решения этой проблемы заложил метод прямого преобразования фибробластов мышей и крыс в олигодендроглиальные стволовые клетки индуцированного путем принудительной гиперэкспрессии восьми или всего трех транскрипционных факторов Sox10, Olig2 и Zfp536.

Индуцированные кардиомиоциты (иКМ)

Одной из наиболее актуальных задач клинической науки нынешнего столетия является развитие терапевтических стратегий, способных обратить вспять прогрессирование сердечной недостаточности — основной причины инвалидности и смертности населения. Большие надежды в этом плане возлагаются на методы клеточной терапии, которые могли бы предотвратить образование соединительной рубцовой ткани вместо мышечной. Простейшим подходом к решению этой задачи могло бы быть перепрограммирование сердечных фибробластов непосредственно в организме путем доставки в сердце факторов транскрипции или микроРНК. Была предпринята попытка перепрограммировать сердечные фибробласты в кардиомиоцит-подобные клетки in vivo путем гиперэкспрессии в них факторов транскрипции Gata4, Mef2c и Tbx5 (GMT). В случае удачи, такой поход позволил бы превращать рубцовую ткань в мышечную непосредственно в сердце, без необходимости клеточной трансплантации. Эффективность такого перепрограммирования оказалась очень низкой, а фенотип полученных кардиомиоцитов существенно отличался от фенотипа нормальных зрелых кардиомиоцитов. Результатом чего явилась низкая выживаемость перепрограммированных клеток. Позднее в опытах in vitro фенотип удалось несколько исправить (добавлением ESRRG, MESP1, Myocardin, ZFPM2 и TGF-β), но эффективность перепрограммирования осталась низкой. Таким образом, необходимы дальнейшие технические усовершенствования, чтобы сделать эту технологию более применимой для лечения.

Между тем определенные успехи наметились в методах получения кардиомиоцитов in vitro. Так, например, удалось с высокой степенью эффективности получить из ИПСК человека прогениторные сердечные клетки способные, при трансплантации их в сердечную мышцу, снизить её перерождение в рубцовую ткань после инфаркта. С помощью малых молекул и путем активации синтеза β-катенина или же ингибирования синтеза Wnt в ИПСК человека in vitro, удалось повысить эффективность получения кардиомиоцитов до 80 %. Возможно, что в будущем удастся заменить искусственные электрокардиостимуляторы, необходимые людям с медленным или нерегулярным сердцебиением, на биологический кардиостимулятор (пейсмекер) из индуцированных стволовых клеток. Надежду на это вселяют эксперименты в которых поросятам делали инъекцию индуцированных сердечных клеток, способных синхронизировать ритм сердцебиения. Более того, при ишемической кардиомиопатии, вызванной смоделированным на мышах инфарктом миокарда, трансплантация ИПСК способствовала синхронизации поврежденных желудочков сердца, улучшая их проводимость и сократимость за счет активации процессов восстановления .

Лу с соавт. создали биоинженерную конструкцию сердца путем заселения очищенного от клеток (децеллюларизованного) сердца мыши мультипотентными сердечно-сосудистыми прогениторными клетками, полученными из ИПСК человека. Они обнаружили, что мультипотентные сердечно-сосудистые прогениторные клетки направленно мигрируют в соответствии с архитектурой сердца, а прибыв на место, размножаются и дифференцируются в кардиомиоциты, клетки гладких мышц и эндотелиальные клетки, как это необходимо для восстановления утраченной структуры сердца. Очевидно, что внеклеточный матрикс сердца мыши (оставшаяся после удаления клеток мыши подложка сердца) может посылать сигналы мультипотентным сердечно-сосудистым прогениторным клеткам человека, необходимые для их навигации и превращения в специализированные клетки, обеспечивающие нормальную работу сердца. Через 20 дней после перфузии сердца средой содержащей факторы роста, оно, после электростимуляции, начинало биться с темпом 40-50 ударов в минуту и реагировало на медикаменты.

Биоинженерия клеток кровеносных сосудов

Кровеносные сосуды образуют обширные сети, которые в течение всей жизни обеспечивают клетки организма питательными веществами и кислородом. Когда кровеносные сосуды становятся старше, их структура и функции, нередко, отклоняются от нормы, способствуя тем самым многочисленным возрастным заболеваниям, таким как: инфаркт миокарда, ишемический инсульт и атеросклероз артерий, питающих сердце, мозг и нижние конечности. Поэтому, важной задачей является стимулирование роста сосудов для обеспечения циркуляции, чтобы предотвратить обострение этих заболеваний. Одим из способов стимулирования роста сосудов является имплантация индуцированных прогениторных клеток эндотелия (иПЭк). Так, например, с помощью иПЭк, полученных путем частичного перепрограммирования клеток эндотелия, удалось добиться увеличения коронарного кровотока и по данным эхокардиографии улучшить функционирование сердца. Стволовые клетки, извлеченные из жировой ткани после липосакции можно превратить в прогениторные гладкие мышечные клетки (иПГМк), участвующие в формировании артерий и вен. Это клетки могут быть использованы для создания кровеносных сосудов, необходимых для замены неисправных артерий сердца. Так, например, обнаружено, что с помощью культуры ИПСК человека в сочетании с селекцией с помощью трех маркеров: CD34 (поверхностного гликофосфопротеина ранних эмбриональных фибробластов), NP1 (рецептора — нейрофилин1) и KDR (киназы содержащей домен рецептора), удалось получить эндотелиальные клетки, которые после трансплантации мышам образовали in vivo стабильные функциональные кровеносные сосуды, работавшие на протяжении по меньшей мере 280 дней..

При лечении инфаркта миокарда важно предотвратить образование фиброзных тканей шрама и стимулировать регенерацию. Достичь этого in vivo можно применив паракринные факторы способные изменить направление дифференцировки сердечных стволовых клеток предшественников от специализации в фиброзную рубцовую ткань в сторону образования сердечно-сосудистой ткани. Например, на мышиной модели инфаркта миокарда, было показано, что однократная интрамиокардиальная инъекция мРНК фактора роста эндотелия сосудов (VEGF-A modRNA), синтетически модифицированной так чтобы предотвратить ее деградацию организмом, приводит к длительному улучшению функции сердца, обусловленному перенаправлением дифференцировки эпикардиальных клеток-предшественников в сердечно-сосудистый тип клеток .

Прямое перепрограммирование клеток взрослого организма в прогениторные нефроны (ИПН)

Взрослые клетки проксимальных канальцев почки могут быть непосредственно перепрограммированы в прогениторные нефроны эмбриональной почки, с использованием пула из шести генов кодирующих «инструктирующие» факторы транскрипции (SIX1, SIX2, OSR1, Eyes absent homolog 1(EYA1), Homeobox A11 (HOXA11) и Snail homolog 2 (SNAI2)). Возможность получения таких клеток позволит в будущем приступить к разработке методов клеточной терапии почечных заболеваний. Первые успехи на этом пути уже есть. Так, недавно было показано, что эмбриональные органоиды почки, сформированные путем самоорганизации из клеточной суспензии, после трансплантации их во взрослую почку крысы могут в ней прижиться.

Биоинженерия стволовых клеток крови

Эритроциты

Переливание эритроцитов необходимо для многих пациентов с травмами или гематологическими заболеваниями. Однако, на сегодняшний день, поставка эритроцитов зависит от добровольных доноров число которых недостаточно. Кроме того, переливание крови от доноров сопряжено с определенным риском из-за возможности передачи ряда инфекций. Решить эту проблему могло бы производство необходимых количеств эритроцитов вне организма. В принципе уже доказано, что эритроциты, полученные вне организма из мобилизованных CD34-позитивных клеток (CD это на англ. сокращенно кластер дифференцировки), способны выжить при переливании аутологичному реципиенту. Эритроциты, получаемые in vitro, как правило, содержат исключительно зародышевый гемоглобин (HbF), который непригоден для нормального функционирования эритроцитов во взрослом организме. Тем не менее, in vivo, после трансфузии полученных из ИПСК эритроидных прогениторных клеток содержащих ядро, наблюдалось переключение на синтез взрослой изоформы гемоглобина. Однако в этом случае возникает другая проблема: несмотря на то, что эритроциты не имеют ядер, и, следовательно, не могут образовывать опухоли, их непосредственные предшественники эритроидные прогениторные клетки ядром обладают и следовательно потенциально опасны. Созревание эритробластов в функционально зрелые эритроциты требует сложного процесса реорганизации, который заканчивается удалением ядра с образованием безъядерных эритроцитов. Увы, методы перепрограммирования клеток в настоящее время часто приводят к нарушению этих процессов энуклеации и поэтому использование эритроцитов или их непосредственных предшественников эритробластов для переливания ещё недостаточно защищено от возможности образования опухолей. Тем не менее Bouhassira и его коллеги обнаружили, что кратковременное воздействие цитокинов, благоприятствующих дифференциации стволовых клеток в эритроидные, на CD34 позитивные клетки, до их размножения с последующей пролиферацией полученных предшественников, позволяет получать на порядок больший выход эритроидных клеток, чем наблюдалось ранее. И что самое главное: эти красные кровяные клетки имели те же изоформы глобина что и использованные в качестве источника CD34 позитивные клетки Интересно также отметить, что важную роль в развитии нормальных клеток крови играет сигнальный путь рецептора арил-углеводородов (AhR) (который как было установлено, содействует образованию раковых клеток). Активация AhR в человеческих гемопоэтических клетках-предшественницах (HPS) приводит к беспрецедентной пролиферации HPS, мегакариоцитов и клеток эритроидных линий.

Тромбоциты

Тромбоциты играют важную роль в предотвращении кровоизлияния у больных с тромбоцитопенией или с тромбоцитемией. Серьезной проблемой для пациентов после повторных переливаний тромбоцитов является развитие иммунных реакций. Поэтому для клиники большое значение имеет возможность получения тромбоцитов, не содержащих HLA антигены, вне организма и на средах, не содержащих сыворотки. Некоторых успехов в этом направлении добились Figueiredo с соавторами. Используя РНК-интерференцию для подавления синтеза β2-микроглобулина в CD34-положительных клетках они сумели получить тромбоциты, в которых на 85 % было снижено содержание антигенов HLA.

Иммунные клетки

Вырабатываемый иммунной системой специализированный тип белых кровяных клеток, известный как цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), способен распознать специфические маркеры на поверхности различных инфекционных или опухолевых клеток и уничтожить эти вредоносные клетки. Поэтому иммунотерапия с использованием антиген-специфических Т-клеток в будушем может быть использована для борьбы со многими видами рака и вирусных инфекций. Организм производит очень мало таких клеток и выделить их в количестве необходимом для терапии очень сложно. Потенциально эффективным подходом получения этих клеток для терапии может быть технология заключающаяся в том чтобы превратить зрелые CTL в ИПСК, которые обладают способностью к неограниченной пролиферации in vitro, размножить эти ИПСК до необходимого количества и затем провести их дифференцировку обратно в зрелые CTL. Еще большие возможности обещает метод, который сочетает две технологии – 1. получение ИПСК и превращение их в Т-клетки, и 2. последующую их генетическую модификацию, с помощью технологии конструирования химерных рецепторов антигенов (CAR) , позволяющую им распознавать раковые клетки-мишени по антигенам, в частности по CD19 - антигену, синтезируемому злокачественными В-клетками. По аналогичной технологии можно было бы создать распознающие белок PBP2A Т-клетки направленные против устойчивых к антибиотикам бактерий таких как метициллин-резистентный золотистый стафилококк.

Большой клинический потенциал в качестве адъюванта для иммунотерапии рака имеют инвариантные естественные киллеры T (INKT) — клетки, которые могут служить в качестве моста между врожденной и приобретенной иммунной системами. Они повышают противоопухолевую активность организма, производя гамма-интерферон (ИФН-γ). Предложен концептуальный метод использования INKT клеток, полученных из ИПСК, для терапии рака, который состоит из четырех ступеней: (1) выделение минимального количества INKT клеток, (2) перепрограммирования этих INKT клеток в ИПСК, (3) размножение этих ИПСК в культуре и дифференцировка их обратно в INKT клетки и (4) инъекция, полученных INKT клеток, подопытным животным для терапии рака.

Для терапии могут быть использованы также дендритные клетки, которые участвуют в контроле Т-клеточного ответа. После инъекции они могут выжить достаточно долго, чтобы стимулировать антиген-специфические CTL, после чего могут быть полностью устранены. Неисчерпаемым источником для терапии вакцинами могут служить антиген-представляющие дендритные клетки, полученные из человеческих ИПСК.

Индуцированные стволовые/стромальные клетки мезенхимы (ИМСК)

Благодаря своим способностям вызывать иммуносупрессию и способности к дифференцировке во многие типы мезенхимальных тканей, стволовые/стромальные клетки мезенхимы (МСК) интенсивно исследуются на предмет их применения для лечения сердца, почек, нервной ткани, суставов и регенерации костей, а также терапии воспалительных заболеваний и подавления реакции отторжения при трансплантации. МСК, как правило, получают путем болезненных, инвазивных процедур из взрослого костного мозга или жира, при этом выход очищенных МСК составляет всего лишь 0,001 % — 0,01 % от клеток костного мозга и 0,05 % от аспирата липосакции. На практике удобнее всего получать МСК из аспирата липосакции, при этом удаляют взрослые адипоциты, которые успели потерять способность к пролиферации. Между тем взрослые адипоциты легко можно выделить и подвергнуть дедифференцировке в так называемые дедифференцированные жировые клетки (ДДЖК), которые возвращают способность к пролиферации и мультипотентность. При соответствующих условиях культивирования in vitro или окружения in vivo ДДЖК могут дать начало адипогенным, остеогенным, хондрогенным или миогенным прогениторным клеткам, а также стимулировать неоваскуляризацию то есть проявляют те же свойства, что и МСК костного мозга. У пожилых пациентов, которые больше всего нуждаются в восстановлении тканей путем аутологичной клеточной терапии, с возрастом наблюдается резкое возрастное снижение количества и качества МСК и адипоцитов. Вместе с тем, известно, что ИПСК могут быть получены путем омоложения клеток даже от столетних людей. Поэтому ИПСК, которые легко можно получить перепрограммированием клеток из тканей пациента и затем практически неограниченно размножать in vitro, может стать удобным источником омоложенных МСК. Chen с соавт. обнаружили, что воздействуя на ИПСК человека препаратом SB431542 можно достаточно быстро получить однородную культуру клеток ИМСК, которые по свойствам мало чем отличаются от молодых МСК. По мнению авторов статьи такие ИМСК не обладают способностью к образованию тератом и имеют стабильный кариотип, а поэтому могут быть использованы для терапии В настоящее время нет данных об эффективности и долгосрочной безопасности полученных этим методом ИМСК in vivo. Тем не менее, культуры мезенхимальных стволовых клеток человека могут быть использованы in vitro для массового производства экзосом, которые, как выяснилось, идеально подходят в качестве средства для доставки лекарств и для доставки в клетку-мишень факторов транскрипции или микроРНК индуцирующих перепрограммирование (дедифференцировку, дифференцировку или трансдифференцировку).

Источники соматических клеток

Наиболее часто для перепрограммирования используют получаемые биопсией фибробласты кожи и клетки крови, однако удобнее получать соматические клетки из мочи. Этот способ не требует биопсии или взятия образцов крови и поэтому безвреден для пациента. Стволовые клетки мочи имеют способность к мультипотентной дифференциации. Они способны дифференцироваться в эндотелиальные, остеогенные, хондрогенные, адипогенные, скелетные миогенные и нейрогенные линии и вместе с тем не образуют тератомы. Поэтому их эпигенетическая память хорошо подходит для перепрограммирования в ИПСК. Вместе с тем, клеток в моче мало, эффективность их превращения в стволовые клетки низка, тогда как риск бактериального заражения выше, по сравнению с другими источниками клеток.

Еще одним перспективным источником клеток для перепрограммирования являются мезенхимальные стволовые клетки, полученные из фолликулов человеческого волоса.

Важно отметить, что происхождение соматических клеток используемых для перепрограммирования может оказывать влияние на эффективность перепрограммирования, функциональные свойства получаемых индуцированных стволовых клеток и способность к образованию опухолей.

При выборе источника для перепрограммирования, во внимание следует принимать тот факт, что ИПСК сохраняют эпигенетическую память о тканях из которых они произошли, и что это влияет на их способность к направленной дифференциации Остаточная эпигенетическая память не обязательно проявляется на стадии плюрипотентности — ИПСК, полученные из разных тканей имеют надлежащую морфологию, в них активны гены характерные для плюрипотентности, и они способны дифференцироваться в ткани трех эмбриональных слоев как in vitro, так и in vivo. Однако, эта эпигенетическая память может проявиться позже, во время повторной дифференциации в специфические типы клеток, которая требует активации локусов, сохранивших элементы остаточной эпигенетической памяти.

Способы доставки репрограммирующих факторов в ядро

Способы доставки можно подразделить на вирусные и невирусные, а также на те, что связаны с интеграцией векторов несущих репрограммирующие факторы в геном и действующие без интеграции .

(Значками отмечены свойства соответствующего вектора: (+)- Геномная интеграция происходит; (±)- интеграция происходит, но очень редко; (-)- вектор не интегрируется; (тр)- после интеграции векторная конструкция должна быть удалена транспозазой.)

Доставка вирусами

Чаще всего для доставки используются вирусные векторные системы. Вирусы используют свой врожденный механизм заражения клетки, что позволяет использовать их для доставки и внедрения кассеты генов необходимых для экспрессии репрограммирующих факторов В качестве вирусов для доставки генов обычно используют:

• Ретровирусы(+). Они в качестве генома содержат одноцепочечную молекулу РНК. С помощью обратной транскрипции на РНК вируса синтезируется линейная двухцепочечная ДНК которая затем интегрируется в двухцепочечную ДНК генома клетки-хозяина. Описан метод эффективного перепрограммирования клеток человека в ИПСК с помощью одного вектора содержащего четыре ТФ, в сочетании с коктейлем, содержащим три небольшие молекулы. Приведены прописи аналогичных методов.
• Лентивирусы(+). Они являются подклассом ретровирусов. В отличие от ретровирусных векторов, лентивирусные векторы могут заражать не только делящиеся клетки, но и находящиеся в покое терминально дифференцированные клетки.
• Вирус Сендай (-) — вирус из семейства Paramyxoviridae, содержащий одноцепочечную РНК Вирус Сендай считается безопасным, потому что его генетический материал не включается в ДНК клетки, и от него достаточно легко избавиться инкубацией культуры клеток при повышенной температуре. Вирус от тепла погибает, тогда как трансформируемым клеткам такая обработка не вредит.
• Венесуэльский вирус лошадинного энцефалита (VEE) (-) у которого структурные белки удалены, но все еще присутствуют неструктурные белки, позволяет с помощью самореплицирующегося полицистронного репликона РНК внести в клетку однократной трансфекцией четыре перепрограммирующих фактора (OCT4, KLF4, SOX2 и либо c-MYC либо GLIS1) .
• Не интегрирующиеся аденовирусы (±) По мнению некоторых авторов векторную кассету, после того как перепрограммирование достигнуто, можно удалить с помощью трансфекции мРНК Cre рекомбиназы, что якобы позволяет сочетать высокую эффективность вирусной доставки с достоинствами перепрограммированных клеток, свободных от остатков трансгенов, которые могут вызывать злокачественную трансформацию.

Невирусная доставка векторов

По сравнению с вирусными векторами, не-вирусные векторы являются потенциально менее иммуногенными и их сравнительно легче использовать в условиях клиники.

Невирусным подходом является прямая доставка в клетку синтетической мРНК(-) кодирующей четыре канонических фактора Яманаки: KLF4, c-MYC, OCT4, и SOX2. Метод позволяет достичь высокой эффективности перепрограммирования, но технически сложен и сильно зависит от качества реактивов. Недавно он был модифицирован, что позволило сократить продолжительность процесса и число необходимых реагентов.

Перепрограммирование мышечных клеток головастиков Xenopus в недифференцированные клетки может быть достигнуто In vivo с помощью ДНК(±) мыши кодирующей Oct4, Sox2, и Klf4 в условиях способствующих регенерации.

Привлекательным методом невирусной доставки генов, который позволяет эффективно встраивать желаемую ДНК в геном различных клеток является использование транспозонов — сложных структур содержащих дискретные куски ДНК, обладающие способностью изменять свое местоположение в геноме посредством механизма транспозиции (инсерции), вынуждающего его включиться или наоборот покинуть определенный участок генома. Транспозон состоит из инсерционных сегментов ДНК, которые могут перемещаться как единое целое, захватывая лежащие между ними гены. Описано несколько транспозонных систем пригодных для транспортировки генов в клетки млекопитающих. Это «Спящая красавица» — Sleeping Beauty (SB), SB100X, и Tol2 и PiggyBac (PB). Разработаны эффективные методики получения ИПСК мыши и человека введением в соматические клетки векторов на основе PiggyBac (тр) В том числе с кассетой из ДНК кодирующей 6 факторов (Oct4, c-Myc, Klf4, Sox2 плюс Rarg (retinoic acid receptor gamma — RAR-γ) и Lrh-1 (liver receptor homologue 1 известный также как Nr5a2)., что позволило сократить продолжительность перепрограммирования до 4-12 дней и поднять его эффективность до уровня сопоставимого с методами переноса ядер и слияния клеток.

Векторные системы на основе эписомных плазмид(±). Перепрограммирование основанное на использовании эписомных плазмид считается наиболее эффективным и безопасным так как не требует интеграции трансгенов в геном. Однако первоначально эффективность перепрограммирования этим методом была крайне низка (менее 0,0002 %.) . Значительно увеличить эффективность индукции ИПСК позволило использование комбинации плазмид, кодирующих OCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28 и малой интерферирующей РНК для ингибирования гена TP53, кодирующего белок p53 (супрессор опухолей, ингибирующий перепрограммирование) в сочетании с Эпштейн-Барр ядерным антигеном 1 (EBNA1), который является белком вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), необходимым для амплификации эписомных векторов Разработаны полицистронные свободные от вирусов плазмиды (±), содержащие последовательности самовыщепляющегося 2A пептида (пептида, который взаимодействуя с рибосомой инициирует отделение от растущего полипротеина, вызвав «пропуск» последней пептидной связи на С-конце 2А) и постоянно активный промотор вируса энцефаломиокардита (CMV).

Рекомбинантные белки (-) представляют собой проникающие в ядро белки, полученные путем рекомбинации (в данном случае, присоединения последовательности, кодирующей поли-аргининовый домен трансдукции, к генам четырех перепрограммирующих факторов: Oct4, Sox2, Klf4 и C-Myc, на участке соответствующем их С-концевой последовательности, и, кроме того, постоянно активного промотора вируса энцефаломиокардита) с последующим синтезом этих белков в тельцах включения бактерии E.coli. Выделенные из E. coli и очищенные рекомбинантные белки используются для перепрограммирования без интеграции. Эффективность перепрограммирования с помощью рекомбинантных белков ничтожно мала, но может быть существенно увеличена при воспалении вызываемом поли I:C (синтетическим аналогом двухцепочечной РНК)

Химически индуцированные плюрипотентные клетки (ХИПСК)

Используя для перепрограммирования исключительно малые молекулы, китайские ученые Дэн Хонгкуй с коллегами показали, что для перепрограммирования клеток достаточно эндогенных «мастер генов». Они индуцировали плюрипотентное состояние у взрослых клеток мыши, используя семь низкомолекулярных соединений. Эффективность метода оказалась достаточно высокой: она была в состоянии преобразовать 0,2 % взрослых клеток ткани в ИПСК, что сопоставимо с результатами получаемыми при использовании экзогенных «мастер генов» доставляемых вирусными векторами. Авторы отмечают, что полученные от мышей CiPSCs были на «100 % жизнеспособными и здоровы на протяжении, по меньшей мере, 6 месяцев наблюдения». В число этих семи низкомолекулярных соединений входили:

• вальпроевая кислота - жирная кислота с разветвленной цепью – ингибитор гистондезацетилазы , повышает эффективность перепрограммирования соматических мышиных эмбриональных фибробластов (примерно в 100 раз), способствуя активации генов плюрипотентности и репрессии генов линейной дифференцировки .
• ингибитор GSK3 — гликоген синтез киназы 3 (CHIR) (подробнее см.). Ингибирование GSK3 имитирует активацию сигнального пути Wnt в результате чего β-катенин избежав деградации входит в ядро, где активирует синтез ферментативной субъединицы теломеразы (TERT);
• ингибитор трансформирующего ростового фактора бета (E-616452). Низкомолекулярный ингибитор TGF-[бета] сигнализации в ходе перепрограммирования заменяет Sox2 активируя Nanog.,;
• ингибитор моноаминоксидазы антидепрессант транилципромин одновременно является еще и ингибитором деметилазы которая избирательно удаляет метильные группы с лизина в положении Лиз4 или Лиз9 гистона H3. Действуя на хроматин транилципромин вызывает глобальное увеличение H3K4 метилирования и как следствие этого дерепрессию генов . Интересно отметить, что ингибиторы деметилаз обладают еще и способностью подавлять избыточную пролиферацию клеток и таким образом подавлять развитие раковых опухолей
• Форсколин (forskolin) — препарат активирующий аденилатциклазу — фермент катализирующий превращение АТФ в цАМФ;
• ингибитор гидролазы S-аденозилгомоцистеина (под названием 3-деазанепланоцин (DZNep)), вещество вызывающее разрушение поликомб репрессорного комплекса PRC2 и ингибирующее метилирование гистонов.
• PD-0325901 - высокоизбирательный и сильнодействующий синтетический ингибитор митоген-активируемой протеинкиназы MEK, избирательно фосфорилирующей серин / треонин и остатки тирозина в активационной петле ее субстратов. PD-0325901 проходит испытания в качестве противоопухолевого препарата.

Методы и составы «коктейлей» из малых молекул для химического воздействия на мышечную ткань с целью активации процессов образования функциональных сердечных, скелетных и гладкомышечных клеток и регенерации поврежденных тканей in situ можно найти в обзоре Джанга и Виллиамса. С механизмами действия малых молекул при перепрограммировании можно ознакомиться в обзоре Квин с соавт.

Перспективы изучения индуцированных стволовых клеток для медицины

Ярким свидетельством значения индуцированных стволовых клеток для медицины будущего и всего человечества, стало присуждение Джону Гордону и Синъе Яманаке Нобелевской премии 2012 года по медицине. Бо́льшую часть от выигранного приза в £750,000 Синъя Яманака решил потратить на развитие своих исследований.

Литература

• Подробные протоколы методов перепрограммирования и анализа полученных ИПСК
• Shinya Yamanaka (2012) Induced Pluripotent Stem Cells: Past, Present, and Future. Cell Stem Cell, 10(6), 678—684, doi:10.1016/j.stem.2012.05.005
• Kazutoshi Takahashi and Shinya Yamanaka (2013) Induced pluripotent stem cells in medicine and biology. Development, 140, 2457-2461. doi:10.1242/dev.092551
• Lensch, M. W., & Mummery, C. L. (2013) From Stealing Fire to Cellular Reprogramming: A Scientific History Leading to the 2012 Nobel Prize. Stem Cell Reports, 1(1), 5-17 doi:10.1016/j.stemcr.2013.05.001
• Jackson S. A., Sridharan R. (2013) Peering into the Black Box of Reprogramming to the Pluripotent State. Current Pathobiology Reports, 1(2), 129-136 doi:10.1007/s40139-013-0014-y
• Grace E. Asuelime and Yanhong Shi (2012) A case of cellular alchemy: lineage reprogramming and its potential in regenerative medicine J Mol Cell Biol (2012) doi:10.1093/jmcb/mjs005
• Ji Lin, Mei-rong Li, Dong-dong Ti, et al. & Wei-dong Han (2013) Microenvironment-evoked cell lineage conversion: Shifting the focus from internal reprogramming to external forcing Ageing Research Reviews
• Takahashi K. (2012) Cellular reprogramming — lowering gravity on Waddington’s epigenetic landscape. J Cell Sci.; 125 (11), 2553—2560. doi:10.1242/jcs.084822
• Чугунов А.(2012) Нобелевская премия по физиологии и медицине (2012): индуцированные стволовые клетки.
• Samer MI Hussein, Andras A Nagy (2012) Progress made in the reprogramming field: new factors, new strategies and a new outlook. Current Opinion in Genetics & Development. 22(5), 435—443 doi:10.1016/j.gde.2012.08.007
• Yemin Zhang, Lin Yao, Xiya Yu, Jun Ou, Ning Hui and Shanrong Liu (2012) A poor imitation of a natural process: A call to reconsider the iPSC engineering technique. Cell Cycle , 11(24) , 4536 — 4544
• Ignacio Sancho-Martinez, Sung Hee Baek & Juan Carlos Izpisua Belmonte (2012) Lineage conversion methodologies meet the reprogramming toolbox. Nature Cell Biology, 14, 892—899 doi:10.1038/ncb2567
• Mochiduki, Y. and Okita, K. (2012) Methods for iPS cell generation for basic research and clinical applications. Biotechnology Journal, 7: 789—797. doi:10.1002/biot.201100356
• Rosalinda Madonna (2012) Human-Induced Pluripotent Stem Cells: In Quest of Clinical Applications Molecular Biotechnology , 52(2), 193—203 doi:10.1007/s12033-012-9504-0
• M. Lorenzo, A. Fleischer, D. Bachiller (2012) Generation of Mouse and Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) from Primary Somatic Cells. Stem Cell Reviews and Reports doi:10.1007/s12015-012-9412-5 (подробное описание методик)