Малые интерферирующие РНК

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск

Ма́лые интерфери́рующие РНК или короткие интерферирующие РНК (англ. siRNA, small interfering RNA) — это класс двухцепочечных РНК, длиной 20-25 нуклеотидов. Малые интерферирующие РНК принимают участие в процессах РНК-интерференции (англ. RNAi), понижая экспрессию специфических генов.

Малые интерферирующие РНК принимают участие в реакциях РНК-интерференции, например, в противовирусных реакциях и поддержании структуры хроматина. Молекулярные механизмы данных взаимодействий в настоящее время исследуются, в частности, была предложена гипотеза участия малых РНК в РНК-зависимом метилировании ДНК[1].

История[править | править исходный текст]

Малые интерферирующие РНК были открыты в 1999 году группой Дэвида Болкомба (англ. David Baulcombe) в Великобритании как компонент системы пост-транскрипционного сайленсинга генов у растений (англ. PTGS, en:post-transcriptional gene silencing). Группа опубликовала полученные данные в журнале Science[2].

В 2001 году группой Томаса Тущла (англ. Thomas Tuschl) было показано, что синтетические малые интерферирующие РНК могут индуцировать РНК-интерференцию в клетках млекопитающих. Соответствующие результаты были опубликованы в журнале Nature[3]. Это открытие привело к росту интереса к использованию РНК-интерференции для биомедицинских исследований и разработки лекарственных препаратов.

Структура[править | править исходный текст]

Малые интерферирующие РНК представляют собой короткие (как правило, длиной 21 нуклеотид) двухцепочечные РНК с двумя неспаренными выступающими нуклеотидами на 3'-концах.

Механизм синтеза малых интерферирующих РНК

Каждая из двух цепей РНК имеет фосфатную группу на 5'-конце и гидроксильную группу на 3'-конце. Короткие интерферирующие РНК с такой структурой образуются в результате активности фермента Dicer, субстратами которого являются длинные двухцепочечные РНК или короткие РНК, содержащие шпильки[4]. Малые интерферирующие РНК могут быть искусственно введены в клетки для нокдауна определенного гена. При этом экспрессия практически любого гена с известной последовательностью нуклеотидов может быть целенаправленно изменена. Данное свойство делает короткие интерферирующие РНК удобным инструментом для исследования функций генов и изучения мишеней лекарственных средств.

Индукция РНК-интерференции[править | править исходный текст]

Dicer protein colored by protein domain.

Целенаправленное подавление экспрессии генов с помощью трансфекции экзогенной интерферирующей РНК в клетки связано с определенными трудностями, поскольку нокдаун гена в этом случае имеет временный характер, особенно в быстро делящихся клетках. Один из способов преодоления этих трудностей состоит в том, чтобы ввести в клетку вектор, обеспечивающий экспрессию соответствующей малой интерферирующей РНК в течение более длительного периода времени[5]. Такой вектор, как правило, содержит промотор U6 или H1, обеспечивающий транскрипцию РНК полимеразой III, которая транскрибирует малые ядерные РНК. За промотором следуют короткая последовательность нуклеотидов из гена-мишени (19—29 нуклеотидов) и последовательность комплементарная ей, разделенные между собой 4—11 нуклеотидами. Соответствующий транскрипт образует шпильку в результате комплементарного спаривания последовательностей в его начале и конце. Предполагается (хотя это не установлено достоверно), что такие шпильки затем превращаются в короткие интерферирующие РНК под действием фермента Dicer.

РНК-зависимая активация генов[править | править исходный текст]

Двухцепочечные РНК могут усиливать экспрессию генов по механизму, называемому РНК-зависимой активацией генов (англ. RNAa, small RNA-induced gene activation). Показано, что двухцепочечные РНК, комплементарные промоторам генов-мишеней, вызывают активацию соответствующих генов. РНК-зависимая активация при введении синтетических двухцепочечных РНК была показана для клеток человека. Не известно, имеется ли подобная система в клетках других организмов.[6]

Исключение неспецифических эффектов[править | править исходный текст]

Поскольку РНК-интерференция пересекается со множеством других цепочек реакций, при экспериментальном введении малых интерферирующх РНК могут включаться неспецифические эффекты. Появление двухцепочечных РНК в клетках млекопитающих может быть следствием заражения вирусом и поэтому приводит к запуску иммунного ответа. Более того, так как структурно похожие микроРНК изменяют экспрессию генов путем неполного спаривания с мишенью мРНК, введение малых интерферирующих РНК может вызвать нежелательный побочный эффект.

Врожденный иммунитет[править | править исходный текст]

Введение значительного количества малых интерферирующих РНК может вызвать побочные эффекты из-за того, что включается врожденный иммунный ответ. Вероятно это происходит из-за активации протеинкиназы R, которая чувствительна к малым интерферирующим РНК, возможно также участие гена RIG I (англ. retinoic acid inducible gene I). Также описана индукции цитокинов через рецептор TLR 7 (англ. toll-like receptor 7). Один из перспективных методов снижения побочных эффектов состоит в преобразовании малых интерферирующих РНК в микроРНК. МикроРНК синтезируются в норме, поэтому сравнительно небольшая концентрация образующихся малых интерферирующих РНК можно приводить к сравнимому по силе эффекту нокдауна генов. Это должно свести к минимуму побочные эффекты.

Побочные эффекты[править | править исходный текст]

Сбой мишени --- это еще одна трудность при использовании малых интерферирующих РНК как инструмента для достижения нокдауна генов. Гены с неполной комплементарностью блокируются малыми интерферирующими РНК (т. е. фактически малые интерферирующие РНК действуют как микроРНК), что приводит к трудностям в интерпретации результатов опытов и содержит риск токсичности. Однако, этого можно избежать, организуя соответствующие контрольные опыты, и создавая алгоритмы конструирования малых интерферирующих РНК, которые приводят к таким РНК, не дающим сбоев мишени. Затем можно проанализировать экспрессию генов по всему геному, например, при помощи метода микромассивов (англ. microarray technology), чтобы проверить отсутствие сбоев мишени и произвести дальнейшую настройку алгоритмов. В статье сотрудников лаборатории доктора Хворовой за 2006 год рассматриваются фрагменты длиной 6 или 7 пар оснований, начинающиеся с позиции 2, в малой интерферирующей РНК, соответствующей участку 3’UTR в генах, где происходит сбой мишени[7].

Возможные применения в терапии и препятствия к этому[править | править исходный текст]

Давая возможность выключить по существу любой ген по желанию, РНК-интерференция на основе малых интерферирующих РНК вызвала огромный интерес в фундаментальной [8] и прикладной биологии. Число широкоохватных тестов на базе РНК-интерференции для выявления важных генов в биохимических путях постоянно растет. Поскольку развитие болезней также обусловлено активностью генов, ожидается, что в некоторых случаях выключение гена при помощи малой интерферирующей РНК может давать терапевтический эффект.

Однако применение РНК-интерференции на основе малых интерферирующих РНК к животным, и в особенности к людям, сталкивается со множеством трудностей. В экспериментах было показано, что эффективность малых интерферирующих РНК оказывается различной для разных типов клеток: одни клетки легко откликаются на воздействие малых интерферирующих РНК и демонстрируют снижение экспрессии генов, в других же подобного не наблюдается, несмотря на эффективную трансфекцию. Причины этого явления пока что плохо изучены.

Результаты первой фазы испытаний двух первых терапевтических препаратов, действующих по механизму РНК-интерференции (предназначены для лечения макулодистрофии), опубликованные в конце 2005 года, показывают, что препараты на основе малых интерферирующих РНК легко переносятся пациентами и имеют приемлемые факмакокинетические свойства[9].

Предварительные клинические испытания малых интерферирующих РНК, нацеленных на вирус Эбола, указывают на то, что они могут быть эффективны для постконтактной профилактики заболевания. Данный препарат позволил выжить всей группе подопытных приматов, получивших летальную дозу Заирского Эболавируса[10].

Примечания[править | править исходный текст]

  1. Галицкий В.А. (2008). «Гипотеза о механизме инициации малыми РНК метилирования ДНК de novo и аллельного исключения» (русский). Цитология 50(4): 277–286.
  2. Hamilton A, Baulcombe D (1999). «A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants». Science 286 (5441): 950–2. DOI:10.1126/science.286.5441.950. PMID 10542148.
  3. Elbashir S, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T (2001). «Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells». Nature 411 (6836): 494–8. DOI:10.1038/35078107. PMID 11373684.
  4. Bernstein E, Caudy A, Hammond S, Hannon G (2001). «Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference». Nature 409 (6818): 363–6. DOI:10.1038/35053110. PMID 11201747.
  5. Miyagishi M, Taira K (2002). «Development and application of siRNA expression vector». Nucleic Acids Research Supplement 2: 113—114. PMID 12903131.
  6. Li LC Small RNA-Mediated Gene Activation // RNA and the Regulation of Gene Expression: A Hidden Layer of Complexity. — Caister Academic Press, 2008. — ISBN ISBN 978-1-904455-25-7
  7. Birmingham A, Anderson E, Reynolds A, Ilsley-Tyree D, Leake D, Fedorov Y, Baskerville S, Maksimova E, Robinson K, Karpilow J, Marshall W, Khvorova A (2006). «3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets». Nat Methods 3 (3): 199–204. DOI:10.1038/nmeth854. PMID 16489337.
  8. Alekseev OM, Richardson RT, Alekseev O, O'Rand MG (2009). «Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP». Reproductive Biology and Endocrinology 7: 45. DOI:10.1186/1477-7827-7-45. PMID 19439102.
  9. Tansey B. Macular degeneration treatment interferes with RNA messages, San Francisco Chronicle (11 August 2006).
  10. Postexposure protection of non-human primates against a lethal Ebola virus challenge with RNA interference: a proof-of-concept study Prof Thomas W Geisbert PhD,Amy CH Lee MSc,Marjorie Robbins PhD,Joan B Geisbert,Anna N Honko PhD,Vandana Sood MSc,Joshua C Johnson BSc,Susan de Jong PhD,Iran Tavakoli BSc,Adam Judge PhD,Lisa E Hensley PhD,Ian MacLachlan PhD The Lancet - 29 May 2010 ( Vol. 375, Issue 9729, Pages 1896-1905 ) DOI: 10.1016/S0140-6736(10)60357-1