CRISPR

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск
Диаграмма, иллюстрирующая возможный механизм CRISPR.

Короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (англ. CRISPR — Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) — это прямые повторы и разделяющие их уникальные последовательности в ДНК бактерий и архей, которые совместно с ассоциированными генами (Cas, англ. CRISPR-associated genes) обеспечивают защиту клетки от чужеродных генетических элементов (бактериофагов, плазмид). CRISPR-кассеты обнаружены в геномах многих бактерий и большинства архей[1]. Повторы имеют длину от 24 до 48 пар нуклеотидов; они имеют бивалентную симметрию (англ. dyad symmetry), но, как правило, не являются истинными палиндромами. Повторы разделены вариабельными участками ДНК, спейсерами, примерно одинаковой длины. Спейсеры соответствуют по нуклеотидной последовательности определённым фрагментам ДНК чужеродных генетических элементов (протоспейсерам). В связи с этим было предположено и затем показано, что последовательности, разделяющие повторы, происходят из последовательностей геномов бактериофагов, и, соответственно, обеспечивают защиту клеток от инфекций.

Электронная микрофотография множества бактериофагов, прикрепившихся к бактериальной клеточной стенке

В результате исследований механизма действия CRISPR-системы было сделано предположение, что она является прокариотическим аналогом системы РНК-интерференции эукариот и обеспечивает бактериям и археям защиту от бактериофагов[2].

Роль в генетической регуляции эндогенных бактериальных генов[править | править вики-текст]

Патогенные и синантропные бактерии содержат большое количество белка Cas9 (англ. CRISPR-associated 9). Было показано, что система CRISPR/Cas может активно участвовать в регуляции эндогенных бактериальных генов, в частности, при взаимодействии бактерий с эукариотическим организмом, в котором они паразитируют. Например, белок Cas9 из Francisella novicida использует уникальную, CRISPR/Cas-ассоциированную малую РНК (scaRNA) для подавления эндогенного транскрипта мРНК, кодирующего бактериальный липопротеин, что позволяет ей ослабить иммунный ответ хозяина и повысить её вирулентность[3].

Методы генной инженерии, базирующиеся на системе CRISPR/Cas9[править | править вики-текст]

Разработаны способы высокоизбирательного активирования[4] и ингибирования генов[5], базирующиеся на системе CRISPR/Cas9 (CRISPR-системе II типа)[6][7][8][9][10][11][12][13]. Основными компонентами CRISPR-системы II типа являются CRISPR-кассета, на основе которой синтезируются направляющие crРНК (англ. CRISPR RNA), нуклеаза Cas9 (Csn1) и tracrРНК (англ. trans-activating crRNA), необходимая для процессинга направляющей РНК[1][14][15]. Для направленного редактирования генома эукариотических клеток используют Cas9 Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Neisseria meningitidis[16][17], а также Cas9 из Staphylococcus aureus (SaCas9), которая на 25% меньше по размерам, что позволяет упаковывать ее в аденоассоциированный вирус (AAV) для доставки вектора в клетки живого организма, в качестве терапевтического средства[18][19][20]. Происхождение фермента накладывает некоторые ограничения на выбор ДНК-мишеней: например при использовании Cas9 S. pyogenes в качестве мишеней можно выбирать только последовательности, за которыми следует 5'-NGG (где N — любой нуклеотид). Перед использованием в генетических конструкциях ген Cas9 должен быть предварительно оптимизирован по используемым кодонам в соответствии с организмом, геном которого предполагается модифицировать[14].

С целью упрощения манипуляций с клонированием лентивирусных или ретровирусных векторов доставки, crРНК и tracrРНК объединяют в одну цельную РНК — так называемый «all-in-one CRISPR-Cas9 cloning vector».[21] Это позволяет облегчить конструирование и клонирование серии векторов доставки отличающихся только по пришитой к tracrRNA цепочке «гидРНК», узнающей комплементарную ей, последовательность ДНК, выбранную в геноме по заказу исследователя[22].

Модификация ДНК-связывающего домена Cas9 и его слияние c различными регуляторными доменами позволяет получить избирательно направляемые на нужные участки генома с помощью РНК-гидов искусственные факторы транскрипции (crisprTF) и эффекторы[23], искусственные эндонуклеазы рестрикции[24][25], репрессоры, а также ферменты, модифицирующие эпигеном, такие как ДНК-метилазы, деметилазы и гистонацетилтрансферазы, что позволило избирательно регулировать активность определенных генов[26]. Кроме того найдены аналоги Cas9, которые способны расщеплять вместо ДНК молекулы РНК, что позволит редактировать или избирательно подавлять активность микроРНК[27][28]. Так, например, Cas9 из грамотрицательной бактерии Francisella novicida (FnCas9) может быть перепрограммирован так чтобы нацелить его на РНК геном вируса гепатита С, что приводит к ингибированию синтеза вирусного белка в эукариотических клетках[29]. На основе этой системы можно создать сотни средств для обороны против различных вирусов.

Метод сайт-селективного редактирования генома с помощью фермента, узнающего необходимую последовательность цепи ДНК «по наводке» комплементарного ей РНК «гида», обещает революционные перемены в исследованиях и лечении целого ряда заболеваний, от рака[30] и неизлечимых вирусных болезней до наследственных генетических расстройств вроде серповидноклеточной анемии и синдрома Дауна[31]. Он позволил удешевить, упростить и ускорить разработку генномодифицированных микроорганизмов[32], растений[33][34] и домашнего скота, а также поможет разработке генной терапии наследственных заболеваний у человеческих эмбрионов[35][36].

Методы исследования, базирующиеся на системе CRISPR/Cas9[править | править вики-текст]

Прикрепив к белку Cas9 дефектному по эндонуклеазной активности Зелёный флуоресцентный белок EGFP можно получить инструмент для визуализации геномных последовательностей в живых клетках млекопитающих и визуального определения длины теломер хромосомы, а также отслеживать динамику генных локусов в течение клеточного цикла.[37]

Примечания[править | править вики-текст]

  1. 1 2 Makarova K. S., Haft D. H., Barrangou R., Brouns S. J., Charpentier E., Horvath P., Moineau S., Mojica F. J., Wolf Y. I., Yakunin A. F., van der Oost J., Koonin E. V. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. (англ.) // Nature reviews. Microbiology. — 2011. — Vol. 9. — № 6. — P. 467–477. — DOI:10.1038/nrmicro2577 — PMID 21552286. исправить
  2. Kira S. Makarova, Yuri I. Wolf and Eugene V. Koonin (2013) Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. Nucl. Acids Res. 41(8): 4360-4377. doi: 10.1093/nar/gkt157
  3. Sampson TR, Saroj SD, Llewellyn AC, Tzeng YL, Weiss DS.(2013). A CRISPR/Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence. Nature; 497(7448), 254—257. DOI:10.1038/nature12048.
  4. Pablo Perez-Pinera et al.(2013) RNA-Guided Human Gene Activation by CRISPR/Cas9-Based Engineered Transcription Factors. Nature Methods 10, 973—976 doi:10.1038/nmeth.2600
  5. Lei S. Qi, Matthew H. Larson, Luke A. Gilbert, Jennifer A. Doudna, Jonathan S. Weissman, Adam P. Arkin, Wendell A. Lim.(2013) Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression. Cell, 152 (5): 1173—1183 DOI:10.1016/j.cell.2013.02.022
  6. Cho, S.W., Kim, S., Kim, J.M., and Kim, J.-S (2013) Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat. Biotechnol. doi:10.1038/nbt.2507
  7. Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., et al. (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819—823
  8. Hwang, W.Y., Fu, Y., Reyon, D., et al. and Joung, J.K. (2013) Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. ,doi:10.1038/nbt.2501
  9. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., and Marraffini, L.A. (2013) RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat. Biotechnol. ,doi:10.1038/nbt.2508
  10. Jinek, M., East, A., Cheng, A., Lin, S., Ma, E., and Doudna, J. (2013) RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471. http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00471.001
  11. Mali, P., Yang, L., Esvelt, K.M., et al. and Church, G.M. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823—826.
  12. Wang, H; Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R. (2013) One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell 153 (4): 910-8. doi:10.1016/j.cell.2013.04.025.
  13. Houa, Z; Zhangb,Y; Propsona, N; Howdena, S; Chua, L; Sontheimerb, E; and Thomson, J. (2013) Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. PNAS. doi:10.1073/pnas.1313587110
  14. 1 2 Ran F. A., Hsu P. D., Wright J., Agarwala V., Scott D. A., Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. (англ.) // Nature protocols. — 2013. — Vol. 8. — № 11. — P. 2281–2308. — DOI:10.1038/nprot.2013.143 — PMID 24157548. исправить
  15. Karvelis, T., Gasiunas, G., Miksys, A., Barrangou, R., Horvath, P., & Siksnys, V. (2013). crRNA and tracrRNA guide Cas9-mediated DNA interference in Streptococcus thermophilus. RNA biology, 10(5), 20-19
  16. Hou, Z., Zhang, Y., Propson, N. E.,et al. & Thomson, J. A. (2013). Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. PNAS, 110(39), 15644-15649 doi: 10.1073/pnas.1313587110
  17. Ines Fonfara, Anaïs Le Rhun, Krzysztof Chylinski, Kira Makarova, Anne-Laure Lécrivain, Janek Bzdrenga, Eugene V. Koonin, Emmanuelle Charpentier (2013) Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research
  18. CRISPR Clears Major Obstacle Impeding Its Therapeutic Use. GEN News Highlights
  19. F. Ann Ran, Le Cong, Winston X. Yan,et al., & Feng Zhang (2015). In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. DOI:10.1038/nature14299
  20. A smaller Cas9 protein enables in vivo genome engineering via viral vectors
  21. Malina, A., Mills, J. R., Cencic, R., et al. & Pelletier, J. (2013). Repurposing CRISPR/Cas9 for in situ functional assays. Genes & development, 27(23), 2602—2614. Genes & Dev. . 27:2602-2614 doi:10.1101/gad.227132.113
  22. Heintze, J., Luft, C., & Ketteler, R. (2014).A CRISPR CASe for high-throughput silencing. Frontiers in genetics, 4. 193 doi: 10.3389/fgene.2013.00193
  23. Kearns, N. A., Genga, R. M., Enuameh, M. S.,et al. & Maehr, R. (2014). Cas9 effector-mediated regulation of transcription and differentiation in human pluripotent stem cells. Development, 141(1), 219—223.
  24. John P Guilinger, David B Thompson & David R Liu (2014). Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nature Biotechnology, DOI:10.1038/nbt.2909
  25. Shengdar Q Tsai, Nicolas Wyvekens, Cyd Khayter, et al., & J Keith Joung (2014). Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing. Nature Biotechnology, DOI:10.1038/nbt.2908
  26. Isaac B Hilton, Anthony M D’Ippolito, Christopher M Vockley, Pratiksha I. Thakore, Gregory E Crawford, Timothy E Reddy, Charles A Gersbach.(2015). Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nature Biotechnology, DOI:10.1038/nbt.3199
  27. Mitchell R. O’Connell, Benjamin L. Oakes, Samuel H. Sternberg, Alexandra East-Seletsky, Matias Kaplan, Jennifer A. Doudna. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature, 2014;DOI:10.1038/nature13769
  28. Hale, C. R., Zhao, P., Olson, S.,et al. & Terns, M. P. (2009). RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex. Cell, 139(5), 945—956, doi: 10.1016/j.cell.2009.07.040
  29. Aryn A. Price, Timothy R. Sampson, Hannah K. Ratner, Arash Grakoui, and David S. Weiss. Cas9-mediated targeting of viral RNA in eukaryotic cells. PNAS. DOI:10.1073/pnas.1422340112
  30. Sidi Chen et al., & Feng Zhang, Phillip A. Sharp (2015). Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis. Cell, DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.02.038
  31. Yin, H., Xue, W., Chen, S., Bogorad, R. L., Benedetti, E., Grompe, M., … & Anderson, D. G. (2014). Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nature Biotechnology. DOI:10.1038/nbt.2884
  32. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. & Marraffini, L.A.(2013) RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat. Biotechnol. 31, 233—239
  33. Wenzhi Jiang, Huanbin Zhou, Honghao Bi, Michael Fromm, Bing Yang, and Donald P. Weeks (2013)Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucl. Acids Res. (2013) 41 (20): e188 doi:10.1093/nar/gkt780
  34. Khaoula Belhaj, Angela Chaparro-Garcia, Sophien Kamoun and Vladimir Nekrasov (2013) Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system Plant Methods , 9:39 doi:10.1186/1746-4811-9-39
  35. Giedrius Gasiunas, Virginijus Siksnys (2013) RNA-dependent DNA endonuclease Cas9 of the CRISPR system: Holy Grail of genome editing? Trends in Microbiology, 21(11), 562—567, doi: 10.1016/j.tim.2013.09.001
  36. Uri Ben-David (2013) Flowing through the CRISPR-CAScade: Will genome editing boost cell therapies? Molecular and Cellular Therapies 2013, 1:3 doi:10.1186/2052-8426-1-3
  37. Baohui Chen, Luke A. Gilbert, Beth A. Cimini, et al. & Lei S. Qi, Bo Huang (December 2013) Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System. 155(7), 1479—1491 doi: 10.1016/j.cell.2013.12.001

Литература[править | править вики-текст]

  1. Sampson, T. R. and Weiss, D. S. (2014), Exploiting CRISPR/Cas systems for biotechnology. Bioessays, 36: 34-38. DOI:10.1002/bies.201300135
  2. Chu, V. T., Weber, T., Wefers, B., Wurst, W., Sander, S., Rajewsky, K., & Kühn, R. (2015). Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nature biotechnology. DOI:10.1038/nbt.3198
  3. Cong, L., & Zhang, F. (2015). Genome Engineering Using CRISPR-Cas9 System. In Chromosomal Mutagenesis. Methods in Molecular Biology Vol. 1239, 2015, pp 197-217. Springer New York.
  4. Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., & Nekrasov, V. (2015). Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Current opinion in biotechnology, 32, 76-84. DOI:10.1016/j.copbio.2014.11.007
  5. Who Owns the Biggest Biotech Discovery of the Century? There’s a bitter fight over the patents for CRISPR, a breakthrough new form of DNA editing.
  6. Sander, J. D.; Joung, J. K. (2014). CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. DOI:10.1038/nbt.2842. PMID 24584096.
  7. Kevin Mayer (2014). CRISPR—Fast, Easy … and Increasingly Accurate Genetic Engineering & Biotechnology News.
  8. Terns, R. M.; Terns, M. P. (2014). CRISPR-based technologies: Prokaryotic defense weapons repurposed. Trends in Genetics, 30 (3): 111. DOI:10.1016/j.tig.2014.01.003. PMID 24555991.
  9. Edze R. Westra, Angus Buckling & Peter C. Fineran (2014). CRISPR-Cas systems: beyond adaptive immunity. Nature Reviews Microbiology. DOI:10.1038/nrmicro3241
  10. Rodolphe Barrangou (2014). «Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution». SCIENCE 344 (6185): 707-708. DOI:10.1126/science.1252964.
  11. Джагаров Д.Э. (2014). «Умные ножницы для ДНК». «Химия и жизнь -XXI век» (7).
  12. Джагаров Д.Э. (2014). «Новый метод генной инженерии - CRISPR/Cas9». Academia.edu.
  13. Гоглева А. А., Артамонова И. И. (2014). CRISPR-системы: структура и гипотетические функции. Природа 6 (2014), 16-21;
  14. Гоглева А. А., Артамонова И. И. (2014). CRISPR-системы: механизм действия и применения. Природа 7 (2014), 3-9.
  15. Артамонова И.(2014). CRISPR-системы: иммунизация прокариот «биомолекула.ру»
  16. ELIZABETH PENNISI (2013). «The CRISPR Craze». SCIENCE 341: 834-836.
  17. Jeffry D Sander & J Keith Joung (2014). «CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.». Nature Biotechnology. DOI:10.1038/nbt.2842.
  18. VIDEO: GENESIS™ Precision Genome Editing with CRISPR and rAAV
  19. Timothy R. Sampson and David S. Weiss (2014). «CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology». Front Cell Infect Microbiol. 4: 37. DOI:10.3389/fcimb.2014.00037.
  20. Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G (2005). «CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies». Microbiology 151: 653. DOI:10.1099/mic.0.27437-0. PMID 15758212.
  21. Haft DH, Selengut J, Mongodin EF, Nelson KE (2005). «A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes». PLoS Comput Biol. 1 (6): e60. DOI:10.1371/journal.pcbi.0010060. PMID 16292354.
  22. Makarova KS, Grishin NV, Shabalina SA, Wolf YI, Koonin EV (2006). «A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action». Biol Direct. 1: 7. DOI:10.1186/1745-6150-1-7. PMID 16545108.
  23. Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P. (2007). «CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes». Science 315 (5819): 1709. DOI:10.1126/science.1138140. PMID 17379808.
  24. Sorek R, Kunin V, Hugenholtz P (2007). «CRISPR - a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea». Nat Rev Microbiol 6: 181. DOI:10.1038/nrmicro1793. PMID 18157154.
  25. Andersson AF, Banfield JF (2008). «Virus population dynamics and acquired virus resistance in natural microbial communities». Science 320: 1047. DOI:10.1126/science.1157358. PMID 18497291.
  26. Brouns SJJ, Jore MM, Lundgren M, Westra ER, Slijkhuis RJH, Snijders APL, Dickman MJ, Makarova KS, Koonin EV, Van der Oost J (2008). «Small CRISPR RNAs Guide Antiviral Defense in Prokaryotes». Science 321: 960. DOI:10.1126/science.1159689. PMID 18703739.

Ссылки[править | править вики-текст]